tPA在牛卵母细胞凋亡与成熟进程中的作用研究

本研究以体外成熟过程中的牛卵母细胞为研究对象，利用tPA活性分析、、实时定量RT-PCR与western蛋白检测等多种技术，结合Caspase3活性分析和凋亡早期Annexin 染色等卵母细胞早期凋亡效应检测手段，以及核质成熟检测和体外授精等成熟效果检测技术，构建tPA、生长因子和凋亡因子在牛卵母细胞体外成熟进程中可能的相互调控网络，以揭示tPA调控卵母细胞成熟且或凋亡进程的作用机制，为进一步揭示卵泡成熟与闭锁机制，并提高牛卵母细胞的体外利用率提供实验支持。

为了阐明组织型纤溶酶原激活剂(tPA)及纤溶酶原激活剂抑制因子（PAI）在牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）体外成熟过程中的作用，本项目采用实时定量PCR、酶联免疫、显微操作、牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精和胚胎发育培养等多种技术，结合激光共聚焦和显微操作系统等多种仪器，系统探讨了tPA系统在体外成熟不同时点的表达，tPA和PAI与FSH、卵丘扩散、卵丘增殖、卵丘和卵母细胞间的间隙连接功能之间的可能调控关系，及其对后续胚胎发育能力的影响。结果显示：① 虽然tPA和PAI基因表达随成熟时间（0、8、16、24h）逐渐上升，但是tPA酶活性和Plasminogen基因表达均呈现8h和24h均显著高于0h和16h的趋势，推测tPA和PAI在体外成熟不同时点差异表达彼此协作参与了对卵母细胞成熟的调节；② 体外成熟16h，FSH上调tPA和PAI的基因表达，同时tPA酶活性和PLG基因表达水平显著降低，推测在体外成熟16小时tPA作用被FSH有所抑制，这一抑制效应可能是通过PAI表达上调实现的；③ 体外成熟16h, PAI能够显著促进卵丘细胞中HAS2基因的表达以及卵丘细胞扩散的发生，下调了卵母细胞GDF-9和BMP-15的表达，推测PAI可能是卵丘细胞分泌的促进其自身扩散发生的重要调节因子；④ 在未添加FSH的条件下，tPA能够在体外培养4h显著提升卵丘和卵母细胞之间的间隙连接功能，而这一促进作用在FSH存在条件下被掩盖了；⑤ tPA在体外成熟8h能够促进增殖基因PCNA和CyclinB在卵丘细胞中相对表达；⑥在体外成熟体系中添加tPA，并在8h 后补充添加PAI，能够显著提升牛早期胚胎发育能力；在体外成熟体系中初始添加PAI不利于胚胎后续发育。结论：受FSH调节，tPA和PAI在体外成熟的不同阶段差异表达、彼此协作，参与了对牛卵母细胞体外成熟的调控，影响了其随后的胚胎发育能力。具体表现在，在体外成熟8h前，tPA通过促进卵丘和卵母细胞间的间隙连接功能和卵丘细胞增殖，可能增加了由卵丘至卵母的营养供应，提升了卵母细胞的胞质成熟；在8h之后，PAI通过促进卵丘细胞的扩散，可能提高了精子与卵子的授精能力。两者有序表达和彼此协作，能够显著促进现有成熟体系下牛卵母细胞随后的早期胚胎发育潜力。本研究结果对提升牛卵母细胞的体外利用率具有重要理论和实践价值。