化学修饰法调控核酸酶的序列选择性

Sequence specific nucleases are important enzymatic tools for processing nucleic acids in a predictable and reproducible way. Restriction enzymes are the most commonly used sequence specific nucleases. However, available restriction enzymes could only recognize and cut a limit number of specific sequences. Recombination of sequence-specific nucleases has proven successful, but depending on labor-intensive biological approaches. In this project, we propose a new strategy for regulating the sequence specificity of nucleases via chemical modification. The basic principle is to modify the native non-specific nucleases with chemically synthesized idle template strand so as to induce desired sequence specificity of the nucleases. DNase I and RNase A will be used as the native nucleases, respectively. By changing the sequences of the idle template strand, the sequence specificity of the obtained nuclease@idle-template complex can be flexibly tuned for different target strands. The mechanism for the sequence specificity of the complex will be investigated in detail. The method will be applied to cleave intracellular RNA in situ. Furthermore, the feasibility of the approach for selective cleavage of a short fragment of DNA sequence within genomic DNA will also be tested. The results of this project will offer very useful tools for biological research and genetic engineering field.

人工定向基因修饰是基因工程技术的核心步骤，对特定核酸序列的定向识别和切割依赖于具有序列特异性的核酸工具酶。现有的限制性内切酶种类有限，而现行的用于人工构建新型序列特异性核酸酶的方法主要依赖于生物技术，制备周期长、产量低，影响因素复杂。本项目拟探索发展一种全新的通过对天然酶的体外化学修饰构建序列特异性核酸工具酶的方法。方法的基本原理是利用骨架被化学修饰保护的单链DNA或RNA作为惰性模板序列，分别与天然非限制性核酸内切酶DNase I或RNase A结合形成稳定的核酸酶@惰性模板链复合物。该复合物中酶的活性只有在遇到该模板序列的互补DNA或RNA序列时才被开启，将互补序列水解，而对体系中共存的其他DNA或RNA序列基本没有影响。项目将系统研究复合物的制备方法和获得序列特异性的分子机理，并尝试应用于细胞中目标RNA的原位切割和植物基因组DNA的选择性切割，为生命科学研究提供重要的方法和技术。

对基因组DNA进行特异性定点切割依赖于高效、易得、序列选择性好且可靠通用的分子剪切工具。传统的限制性内切酶种类十分有限，基于蛋白重组构建序列特异性核酸酶的方法制备周期长、产量低，影响因素复杂。CRISPR-Cas9作为一项新兴技术近几年发展迅速，但该技术仍依赖于在目标DNA序列的下游区域包含一段特定的PAM 序列，在一定程度上限制了其通用性。另外，该技术对目标序列中含有单个错配碱基的容忍度较高，导致对点突变目标序列的区分能力有限。本项目发展了一种全新的通过惰性模板硫磷酰化DNA(S-DNA)单链诱导天然非限制性核酸内切酶DNase I获得序列选择性的方法。所构建的sgDNase体系具有单碱基特异性区分能力，只快速切割与S-DNA完全匹配的互补单链，而对体系中共存的其他DNA序列，即使互补区域只有一个碱基错配，水解速率也急剧下降。利用这一特性，本项目构建了针对EGFR、KRAS、BRAF和PIK3CA等突变发生率较高的基因热点突变区域的sgDNase体系，优化获得了最佳组成和制备条件。在此基础上，建立了一套完整的基于选择性消除野生链背景干扰的超高灵敏基因突变检测平台。经过sgDNase处理过的基因组样品，突变链所占的比例显著提高，后续可以根据需要衔接各种检测方法。采用最简单的Sanger测序法即可测出丰度低至0.005-0.01%的突变的存在。与二代测序（NGS）联用，可实现30种以上与疾病密切相关的基因突变的同时高灵敏多重检测。该方法还可与数字液滴PCR(ddPCR)联用，经sgDNase一轮处理，即可实现丰度低至0.1 ppm的基因突变的定量检测。本项目的研究成果是核酸剪切工具开发和基因突变检测领域的重大突破，在临床诊疗特别是液体活检和皮肤活检等领域具有良好的应用前景。所开发的sgDNase基因剪切工具在兴奋剂检测、基因工程等方面也都具有潜在的应用价值。项目迄今共正式发表研究论文10篇，均为SCI收录的国际期刊论文，影响因子都在6.0以上。项目共申请发明专利3项，已获正式授权1项。共培养博士研究生7名，其中4名已毕业并获得博士学位。