人工序列特异性核酸酶辅助的循环肿瘤DNA富集及检测技术的构建与应用

Ciruculating Tumor DNAs (ctDNAs) are DNA fragments originated from cancer cell genomes. Sampling ctDNAs from patients is convenient and non-invasive. Therefore, detection of ctDNAs is promising in cancer diagnosis, especially in early-stage cancer diagnosis. However, current methods for ctDNA detection such as next-generation sequencing and selective PCR are not sensitive enough for early-stage cancer diagnosis. Further improving the sensitivity of such methods will confront problems of high cost and low robustness. So we need to make a breakthrough from other perspectives. In this project, we propose to develop sample pre-treatment methods to eliminate wild-type DNAs from the samples. To achieve this goal, we plan to prepare an artificial sequence-specific nuclease, which is capable of discriminating single-base mismatch. Taking advantages of the positive correlation between the enzymatic kinetics and the abundance of wild-type DNA, we can establish a theoretical model of the enrichment of ctDNA, and based on the model, we are able to break the thermodynamic limit of discrimination toward single-base mismatch and avoid loss of mutant DNA strands during the enrichment process. By coupling with sequencing technologies or our previously reported nucleic acid probes, we will construct an ultrasensitive platform for ctDNA detection. We plan to detect KRAS and EGFR mutations in ctDNAs extracted from the plasma samples of 100-200 patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), within which, 50-100 patients are at the early stage of NSCLC. We will evaluate the clinical practicality of the proposed detection platform, and we anticipate to provide strong analytical tools for cancer diagnosis.

循环肿瘤DNA（ctDNA）是循环系统中流动的来自肿瘤基因组的DNA片段。检测ctDNA具有取样容易、创伤小等特点，对癌症的早期诊断具有重要意义。目前ctDNA的检测技术主要有测序和选择性PCR两大类，但它们的灵敏度无法达到早期诊断的要求，进一步提高其灵敏度将面临高成本、低鲁棒性（Robustness）等困难。因此，需要从检测思路上寻找新突破。本项目拟从“移除样品中野生链”的角度入手，制备可识别单碱基错配的人工序列特异性核酸酶，并利用酶切动力学随野生链丰度变化的关系，构建突变富集的理论模型，解决突变富集领域“区分因子有限”和“突变链损失”的关键问题，并通过与测序技术以及申请人前期发明的核酸探针相结合，建立低丰度ctDNA突变的超灵敏分析平台。项目拟检测100～200例非小细胞肺癌患者（其中早期肺癌50～100例）血浆中的ctDNA突变，评估方法的早期检出率，为癌症的诊疗提供强大的分析工具。

恶性肿瘤是危害人类健康的头号杀手。循环肿瘤DNA（ctDNA）是循环系统中流动的来自肿瘤基因组的DNA片段。检测ctDNA具有取样容易、创伤小等特点，对癌症的早期诊断具有重要意义。目前ctDNA的检测技术的灵敏度无法达到早期诊断的要求，进一步提高其灵敏度将面临高成本、低鲁棒性等困难。因此，需要从检测思路上寻找新突破。本研究中，我们提出了一种解决问题的新思路，采用合适的工具去除野生型DNA可以最大程度上减少它们对于后续检测的干扰从而显著提高检测方法的灵敏度。我们尝试从工具开发入手，通过硫磷酰化DNA链（S-DNA）与脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）的强相互作用构建了新型基因剪切工具—硫磷酰化DNA引导的脱氧核糖核酸酶I（sgDNase）。这种具有单碱基区分能力的序列特异性核酸酶可以精确地切除与硫磷酰化DNA序列完全互补配对的底物链，即使仅具备单碱基差异的突变型DNA仍得以保留。经过测试，我们确定了sgDNase在不同反应温度条件下，不同S-DNA序列条件下针对不同错配类型以及不同长度和序列组成的底物链均表现出了良好的序列选择性和单碱基区分能力。基于sgDNase以上优越的性质，我们成功针对实际致病基因构建了序列特异性核酸酶sgDNase，使待测DNA样品中突变型DNA的丰度提高100～1000倍。在此基础上，我们将sgDNase与Sanger测序法衔接实现了0.01%突变丰度样品的检出。同时，我们实现了目标区域内不同位点不同突变类型的基因突变的同时富集和检出。最后，我们将sgDNase预处理过程与多重PCR衔接起来，在单次实验中同时富集了多种不同位点不同类型基因突变，后续衔接Sanger测序检测法实现了高效率超灵敏多位点突变富集检测。综上所述，sgDNase处理系统可以显著促进全基因组测序的发展，为临床医学诊断和治疗提供有价值的指导信息。