基于蛋白核心识别元件的均相上转换纳米荧光生物传感方法研究

抗体和受体等蛋白质分子类生物识别元件由于具有特异性高、亲和力强、体内稳定性好等优点，被广泛用于临床诊断、疾病治疗及其他与生物相关的分析领域。荧光共振能量转移（FRET）现象为构建实时、均相的生物传感检测方法提供了有力的信号发生手段。然而，对于以蛋白质分子为识别元件的生物传感体系，一直存在供-受体间距离过大，FRET效率低的问题，使检测灵敏度受到限制。另外，生物样品中所含内源性荧光物质的干扰，也对方法的灵敏度造成显著影响。本项目拟通过构建新颖的蛋白核心识别元件，在确保高特异性和高亲和力的同时，最大限度地减小蛋白分子的体积，从而有效提高体系的能量转移效率。同时，拟设计合成具有上转换特性的双光子激发荧光纳米粒子，并通过对纳米粒子表面进行选择性化学修饰，与目标分子实现稳定的共价偶联反应，以期建立标记均一、生物相容性好、灵敏度高、抗干扰能力强的新型实时、均相上转换荧光生物传感检测方法。

本项目围绕构建蛋白核心识别元件和开发实时、均相荧光生物传感检测方法开展研究。成功发展了制备高活性抗体Fab片段的方法，实现了对抗体Fab片段的纳米金标记。利用纳米金猝灭的荧光标记免疫复合物，建立了动态范围可调的均相免疫荧光传感方法。制备了高活性的人雌激素受体蛋白配体结合域片段（ER-LBD），进一步建立了可均相、实时检测雌激素含量变化的受体荧光传感分析方法。合成了具有上转换性质的双光子荧光纳米粒子，初步建立了可灵敏检测雌二醇的上转换纳米生物荧光传感检测方法。项目迄今已正式发表SCI收录国际期刊论文6篇，其中4篇的影响因子在5.0以上。正式授权发明专利1项。共培养博士研究生4名，其中2名已毕业并获得博士学位。项目取得的突出性进展包括：（1）制备了高活性的抗体Fab片段，详细研究了纳米金表面的修饰与蛋白偶联方法，发现采用11-巯基十一酸(MUA)修饰纳米金可以起到稳定纳米金溶胶、减少蛋白在纳米金表面非特异性吸附的作用。同时MUA将羧基引入纳米金表面，通过与抗体蛋白表面的氨基进行共价反应，实现了对抗体的纳米金标记。对照研究了使用不同大小的纳米金颗粒对于荧光猝灭效率的影响。结果表明使用抗体Fab片段与3 nm的纳米金，可以有效减小荧光基团与猝灭基团的距离，提高荧光猝灭效率。利用纳米金猝灭的荧光标记免疫复合物，建立了动态范围可调的均相免疫荧光传感方法。方法操作简便，只需一步反应，在10 min内可得到检测结果，已成功用于检测人唾液中sIgA含量。与传统的免疫分析方法相比，本方法显著简化了操作步骤，提高了检测速度。（2）制备了高活性的双标记人雌激素受体蛋白配体结合域片段(N-His´6-ER-LBD-C-Strep tag II)。金纳米颗粒表面通过MUA修饰链霉亲和素，通过链霉亲和素与受体蛋白上所带标签Strep tag II之间的特异性结合作用，将纳米金标记到受体蛋白上。利用香豆雌酚作为荧光报告分子，与纳米金标记受体蛋白构成FRET体系，构建了可均相、实时检测雌激素含量变化的受体荧光传感分析方法。（3）合成了具有上转换性质的双光子荧光纳米粒子，激发波长800 nm，发射波长550 nm。通过用单链寡核苷酸标记小分子，再利用荧光纳米粒子标记核酸探针分子，初步实现了对雌二醇的上转换纳米生物荧光传感检测。