分步表面印迹法精确制备人工受体纳米材料及其应用

Compared with natural biological molecules, molecularly imprinted polymer (MIP) has the advantages of low cost and high stability. However, the selectivity and affinity of MIPs toward the target molecules are still much lower than those of protein-based antibodies and receptors. In this project, we propose a new strategy of sequential surface imprinting, in order to prepare high-affinity and highly selective artificial receptor nanoparticles for target proteins or peptides. Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) and arginine vasopressin (AVP) will be used as the template molecules for proteins and peptides, respectively. Fe3O4@SiO2 nanoparticles (NPs) will be used as the core structure, on which the template molecules will be first imprinted by using dopamine as the primary functional monomers. Next, with the template molecules retaining in the binding sites of the obtained polydopamine, secondary functional monomers will be added to precisely modify the initial binding sites in the presence of the template molecules. Here, different organic boronic acid molecules will be employed as secondary functional monomers and their performance will be investigated in detail. We will construct a useful library of organic boronic acid functional monomers for protein templates and peptide templates, respectively. The sequential surface imprinting strategy will be optimized for both the protein and the peptide templates. Finally, we will utilize the obtained artificial receptor nanoparticles for extraction, purification and recover proteins from complex biological samples. We will also apply the nanoparticles for in-situ regulation of the protein activity within living cells. For the obtained anti-AVP artificial receptors, we will use them to establish homogeneous fluorescent assays for online detection of AVP in biological samples such as cerebrospinal fluids.

与天然的抗体或受体等生物识别分子相比，分子印迹聚合物（MIP）具有加工成本低、化学稳定性高等优点，但在对目标分子的选择性和亲和力方面仍与天然蛋白存在较大差距。本项目提出一种新的分步表面印迹策略，用于制备高亲和力、高选择性的人工受体纳米材料。项目拟分别选择核酸脱碱基修复蛋白（APE1）和精氨酸加压素（AVP）为模板分子开展研究。以硅包磁纳米颗粒为核心结构，首先采用多巴胺作为功能单体进行一次印迹，之后不洗脱模板蛋白，直接加入合适的有机硼酸功能单体进行二次印迹，从而实现对一次印迹位点的二次精细改进。将分别构建适宜印迹模板蛋白分子和模板短肽分子的有机硼酸小分子功能单体库，优化获得最佳的分步表面印迹方案。项目还将利用所制备的人工受体纳米材料开展复杂样品中蛋白的提取、纯化和回收方法研究，并进一步尝试用于活细胞内蛋白活性的原位调控，以及建立基于人工受体纳米材料的短肽生化传感分析方法。

与天然的抗体或受体等生物识别分子相比，分子印迹聚合物(MIP)具有加工成本低、化学稳定性 高等优点，但在对目标分子的选择性和亲和力等方面仍与天然蛋白存在较大差距。本项目提出了一种新的分步表面印迹策略，拟在传统一步印迹法的基础上，将印迹步骤精细化，其优势在于可以引入更多类型的功能单体，丰富印迹位点的作用力种类，同时，使得功能单体的空间取向和布局更加精准，在选择性和亲和力等方面都更加接近基于蛋白质等生物识别分子。项目分别以核酸脱碱基修复蛋白(APE1)、阿 霉素(DOX)、精氨酸加压素(AVP)和泛素(Ub)等作为分子量不同的代表性模板分子开展了研究。针对APE1蛋白，利用项目负责人前期工作发现的APE1与亲和素之间的特异性相互作用，以亲和素分子作为辅助的蛋白配体，以多巴胺作为分子印迹的功能单体，通过表面印迹法制备了APE1的 磁性分子印迹纳米颗粒。该材料既可作为亲和纯化材料用于从复杂样品中分离富集APE1，又可用作 APE1的可逆纳米抑制剂对APE1进行捕获和活性调控，是一种对金属离子有敏感响应性能的磁性分子印 迹纳米颗粒。在研究中，我们发现了不同蛋白对多巴胺聚合反应产生的显著影响。进一步发展了用罗丹明 B在线实时监控蛋白印迹反应的方法，在氨基功能化的硅包磁珠表面实现了用多巴胺对APE1进行一次印迹的条件最优化。反应完成后，在不洗脱模板分子的情况下，继续加入3-羟基苯硼酸进行二次印迹，成功获得了APE1的分步印迹聚合物，可从细胞裂解液中提取纯化APE1，且保持较高的酶活性。针对AVP 多肽模板分子，我们发现链霉亲和素(SA)对 AVP有较强的结合作用，据此将模板分子固定后，进行多巴胺印迹反应，制备获得了AVP 印迹材料，可用于分离纯化人血清样品中的 AVP。项目还发现和确证了聚多巴胺与泛素之间较强的特异性相互作用。将泛素定向固定在预先包覆磁纳米颗粒的聚多巴胺层表面，然后进行继续进行多巴胺表面印迹反应，再使用mPEG-NH2对非印迹位点进行亲水性修饰，获得了性能良好的磁性泛素印迹材料，其对泛素的亲和力高于泛素结合结构域。利用该印迹材料实现了对泛素体外聚合反应的抑制，并成功从哺乳动物细胞裂解液中分离富集出泛素化蛋白，用于质谱分析。项目迄今共正式发表研究论文7篇，其中6篇为SCI收录的国际期刊论文。共申请发明专利2项，已获正式授权1项。共培养博士生5名，本科生1名。