含靶向SPIO纳米微粒的新型HIV-1慢病毒载体结合基因修饰的EPCs促进脑卒中血管新生机制的研究

Gene therapy has been a new focus on the cerebral ischemia with the development of biotechnology and the molecular mechanism of stroke been studyed more and more profoundly.We have constructed optimized novel human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) lentiviral vector successfully.It's an ideal vector for gene therapy.Because it can infect non-dividing cells, transfer large exogenous gene fragments,and stably and highly express the target gene with reduced autoimmunity.Now we plan to convert VEGF and EGFP gene to HIV-1 lentiviral vector,then combine the the optimized novel HIV-1 lentiviral vector and nm technology to construct SPIO nm microspheres carrying HIV-1 lentiviral vector.We infect the EPCs by the constructed nm microsphere to gain gene modified EPCs.Then we'll transfer the modified EPCs to focal cerebral ischemia model,using the nm microsphere as a tracer to study the mechanism by which EPCs can promote the blood vessel neogenesis.Molecular imaging technology such as PET and MRI and proteomics will be used in our study to observe the nascent vessel in vivo continuously.Our aim is to ally HIV-1 lentiviral vector with visibility of nm microparticle to illuminate the mechanism of EPCs treatment on cerebral ischemia.We want to supply important evidence and visible monitor method for gene therapy transfering from research to clinical application.Our project is designed exactly and the study method is advanced.Then we are sure it has great investigative and practical value.

随着对脑卒中分子机制的认识及生物技术的发展,基因治疗已成为治疗脑缺血的新焦点。本课题组已成功构建了新型HIV-1慢病毒载体，并发现其能携带大片段目的基因，并使目的基因长期稳定表达。本项目拟将VEGF及EGFP基因导入新型HIV-1慢病毒载体，并将其与纳米技术相结合，构建携带HIV-1慢病毒载体的靶向超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米载基因微球并感染内皮祖细胞（EPCs）,获得基因修饰的EPCs，经动脉导管植入局灶性脑缺血大鼠，以SPIO纳米微粒为示踪剂，应用分子影像学与蛋白质组学等技术, 进行新生血管的活体追踪，研究基因修饰的EPCs促进血管新生机制。旨在将慢病毒载体与SPIO纳米微粒整合，阐述EPCs治疗脑缺血的作用机制，并为其临床转化提供重要科学证据及可视化检测方法。本课题设计新颖，研究方法先进,具有重大的科学研究和应用价值。

在中国每年有约700万脑血病患者，近70%为脑梗死。EPCs既具有干细胞特性，也具有ECs特性，在缺血性疾病中，参与血管生成。本实验制备了均一、稳定的Fe3O4 NPs，构建pLVX-VEGF164-IRES-ZsGreen1，从mRNA和蛋白水平上功能鉴定。分离并体外培养EPCs；观察EPCs细胞形态学，免疫荧光染色标记CD133、CD34和KDR。将携带VEGF的慢病毒载体和SPIO感染EPCs，获得VEGF基因修饰和SPIO示踪的EPCs（EPCs-VEGF-SPIO）。立体定位移植PBS、EPCs、EPCs-VEGF和EPCs-VEGF-SPIO到MCAO模型大鼠的侧脑室。通过行为学分子生物学方法分析，比较第1，3，7，14天PBS治疗组和EPCs治疗组的病理变化和治疗效果，探讨和分析MCAO模型建立第7天时，PBS、EPCs和EPCs-VEGF治疗组中HIF-1α，VEGF，MMP-9，CD34，SDF-1和CXCR4的蛋白表达情况。通过MRI成像，实现SPIO的脑内示踪。结果:（1）感染后的EPCs（EPCs-VEGF）绿色荧光表达量70%以上，Western blotting结果EPCs-VEGF的VEGF蛋白表达上调，与EPCs具有统计学差异（P<0.05）。(2)PBS和EPCs立体定位注射到MCAO大鼠的侧脑室，两组大鼠在第7天mNSS、体重比有显著差异（P<0.05）。免疫组织化学和Western blotting结果显示VEGF在第7天表达量达到高峰，CD34逐渐升高，半暗带区的细胞凋亡随时间延长而改善，而HIF-1α在缺血早期高表达，两组间在第3，7，14天存在统计学差异（P<0.05）。(3)PBS、EPCs、EPCs-VEGF和EPCs-VEGF-SPIO立体定位注射到MCAO大鼠的侧脑室，第7天的mNSS，体重比，各组间有显著差异 (P<0.05)。免疫组织化学和Western blotting结果显示VEGF，HIF-1α，CD34，SDF-1和CXCR-4在EPCs-VEGF治疗组表达量最高，MMP-9在PBS组表达量最大，存在统计学差异（P<0.05）。验证了EPCs通过HIF-VEGF和SDF-1/CXCR4信号途径，参与脑梗死的血管新生过程。