TRPCs,STIMs及Orais在钙敏感受体介导钙内流及一氧化氮生成中作用和机制研究

钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)是非兴奋细胞钙内流的主要通道。我们前期研究发现钙敏感受体(CaR)激活介导NO生成中有钙内流参与,SOC及ROC在其中作用、分子组件及作用模式尚不清楚。本课题以精胺与培养的人脐静脉内皮细胞共孵育激活CaR、通过各种工具药分别或同时激活/阻断SOC和ROC为细胞模型，配合TRPCs(TRPC1,3)、STIMs(STIM1,2)、Orais(Orai1,2,3)中和抗体、siRNA技术分别或联合沉默TRPCs 、STIMs 、Orais，免疫印迹、免疫共沉淀等方法检测上述不同细胞模型组中TRPCs、 STIMs和 Orais蛋白表达、共定位、相互结合；荧光探针负载法同步测定细胞内Ca2+和NO生成,阐明SOC和ROC是否以独立或协同方式参与CaR介导钙内流和NO生成，明确TRPCs等钙通道蛋白是否为参与此过程关键分子组件和相互间作用模式。

已有文献报道G蛋白偶联受体C亚组成员钙敏感受体(CaR)激活引起的细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)升高所致钙超载是心肌肥大等多种心血管疾病的共同病理机制。而[Ca2+]i升高可通过胞内Ca2+释放和胞外Ca2+内流两大途径实现，钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)是非兴奋细胞钙内流的主要通道，介导钙内流的C-型瞬时型感受器电位通道TRPCs (TRPC1,3)、基质相互作用分子STIMs (STIM1,2)、Ca2+释放激活的Ca2+通道蛋白质Orais(Orai1,2,3) 是组成SOC和 ROC相关通道组件蛋白。我们前期研究发现CaR激活介导NO生成中有钙内流参与，但SOC及ROC在其中作用、关键分子组件及作用模式尚不清楚。本课题以精胺与培养的人脐静脉内皮细胞共孵育激活CaR、通过各种工具药分别或同时激活/阻断SOC和ROC为细胞模型，配合siRNA技术分别或联合沉默TRPCs (TRPC1, 3)、STIMs (STIM1, 2 )和 Orais (Orai1, 2,3)，检测上述不同细胞模型组中TRPCs、 STIMs和 Orais蛋白表达、共定位、相互结合；荧光探针负载法同步测定细胞内Ca2+和NO生成，阐明SOC和ROC在CaR介导Ca2+内流及NO生成中作用及方式，明确外钙内流相关蛋白TRPCs、Orais、STIMs中哪些亚型为参与上述过程的关键分子组件及关键分子组件相互间作用模式。研究发现：(1)在HUVEC中，CaR在介导的外Ca2+内流和NO的生成中起着重要作用，SOC和ROC均参与了CaR介导Ca2+内流及NO生成，两者以协同方式参与了此过程；(2)TRPC1 、STIM1、 Orai1、Orai2、和Orai3均为参与上述过程关键分子组件，TRPC3 和STIM2没有参与上述过程；(3)证实了在人内皮细胞中TRPC1 、STIM1、Orai1共定位并存在相互作用，TRPC1 、STIM1、 Orai1以三元复合物形式参与了CaR经SOC和ROC介导的Ca2+内流及NO生成。基于上述报道的[Ca2+]i升高在相关心血管生理和病理生理过程中的重要作用，无疑本项目研究将有助于以钙信号系统障碍的多病理机制为靶点，为心血管疾病防治提供新途经。