钙敏感受体在缺氧诱导Aβ过量生成中的作用及其分子机制

研究表明钙敏感受体(CaR)在过氧化状态下易被激活，使胞浆钙离子浓度([Ca2+]i)升高。另有证据显示[Ca2+]i升高或钙振荡可以上调淀粉样前体蛋白(APP)和β-分泌酶1(BACE1)基因的表达。关于CaR在缺氧诱导Aβ过量生成中的作用及其机制，国内外尚未报道。据此并结合预实验结果，申请者设计本项目以验证下述新机制：缺氧通过增加活性氧来活化钙敏感受体，使[Ca2+]i升高和/或产生钙振荡，一方面活化NF-kB，使APP表达增高；另一方面上调BACE1基因表达，导致Aβ生成增多。为验证我们的假说，本课题拟分析缺氧所致的活性氧增多与CaR的活化，[Ca2+]i变化之间的关系；探讨缺氧时CaR的活化与NF-kB活性、APP、BACE1表达以及Aβ 含量变化之间的关系；阐明CaR在缺氧诱导Aβ过量生成中的作用及其机制。本研究将为缺氧诱导Aβ过量生成的分子机制提供新线索，为AD防治提供新靶点。

为了探讨钙敏感受体在缺氧诱导Aβ过量生成中的作用及机制，本项目采用免疫印迹、细胞免疫荧光、免疫组化、Real time PCR和激光共聚焦等技术检测海马神经元和海马组织钙敏感受体、APP以及BACE1的表达；用显微荧光成像技术检测神经元胞浆内钙离子浓度和活性氧含量；利用基于ELISA的改进方法检测海马神经元和海马组织NF-κB活性；运用ELISA方法检测海马神经元培养液和海马组织匀浆液Aβ42和Aβ40含量。研究发现：（1）在细胞和动物水平，缺氧显著增加钙敏感受体mRNA和蛋白的表达；（2）缺氧升高神经元胞浆钙离子浓度，且钙离子浓度的变化部分被钙敏感受体抑制剂Calhex 231所抑制；（3）缺氧通过增加活性氧主要成分之一―H2O2含量，升高神经元胞浆钙离子浓度。采用过氧化氢替代缺氧处理海马神经元，神经元胞浆钙离子浓度明显升高，这种变化不能被钙敏感受体抑制剂Calhex 231所抑制；（4）在细胞和动物水平，缺氧增加NF-κB转录活性，此变化部分被钙敏感受体抑制剂Calhex 231所抑制；（5）海马神经元缺氧处理4h和8h，APP的表达与对照组相比，没有显著差异；（6）在细胞和动物水平，缺氧均显著增加BACE1的表达，钙敏感受体激动剂GdCl3也促进BACE1的表达。进一步研究发现钙敏感受体抑制剂Calhex 231或IP3受体抑制剂Xesto C均部分抑制缺氧时BACE1的高表达；（7）在细胞和动物水平，缺氧显著增加Aβ42和Aβ40生成，钙敏感受体激动剂GdCl3也增加Aβ42和Aβ40生成。进一步研究发现钙敏感受体抑制剂Calhex 231或IP3受体抑制剂Xesto C均部分抑制缺氧时Aβ42和Aβ40的过量生成。根据上述研究结果，本项目得出如下结论：缺氧通过增加钙敏感受体的表达，升高神经元胞浆钙离子浓度，促进BACE1表达，从而使Aβ42和Aβ40过量生成。