miR-4649的乙酰化调控及其对慢性粒细胞白血病致病癌基因Bcr-Abl的抑制作用

Fusion oncogene Bcr-Abl and the gene mutations are the reasons for pathogenesis of chronic myelogenous leukemia and resistance to targeted therapeutic drugs including imatinib, respectively. Inhibition of Bcr-Abl promote the CML cells apoptosis,thus we were promoted to screen microRNAs which can target against Bcr-Abl with an acetylation mechanism .Our preliminary work demonstrated that histone deacetylase inhibitors SAHA and Sodium Butyrate downregulated the expression levels of both Bcr-Abl protein and mRNA in CML cell lines.In addition, SAHA induced 20-fold expression of miR-4649 as compared to untreated CML cell line.Furthermore,online database searching result showed that miR-4669 is the targeted microRNA of both ABL1 and Bcr-Abl.Therefore, we presume that SAHA epigenetically increased the level of miR-4649 which targetd to Bcr-Abl in CML cells. To validate our presumption, we are going to investigate the molecular mechanism underlining acetylation regulatory style of miR-4649 and its direct inhibition effect to Bcr-Abl. In the meanwhile,the translational research will be carried out to investigate the inhibition effects of miR-4649 to primary leukemia cells from CML patients and nude mice CML cell xenograft tumor. Ultimately,it would provide new therapeutic strategy for CML patients expecially those harboring resistance to chemical drugs.

融合基因Bcr-Abl及其基因突变分别为导致慢性粒细胞白血病(CML)发病和对靶向药物如伊马替尼耐药的主要原因。抑制Bcr-Abl 能使CML细胞发生凋亡，因此我们想通过乙酰化调控来筛选抑制Bcr-Abl的microRNA。结果显示，首先用组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA和丁酸钠均能诱导Bcr-Abl的蛋白和mRNA水平显著下调；其次用数据库预测到miR-4649靶向于Bcr-Abl, 同时用芯片筛选发现miR-4649在SAHA处理后升高了20倍。因此推测SAHA通过乙酰化调控miR-4649上调而靶向抑制Bcr-Abl。基于以上结果，进一步将从分子水平揭示miR-4649基因的乙酰化调控机制及其对Bcr-Abl的直接抑制作用。并进行临床转化研究，探讨miR-4649对临床CML病人的原代白血病细胞以及CML细胞系在裸鼠体内成瘤的抑制作用，最终为CML病人特别是耐药病人的治疗提供新的思路。

融合基因Bcr-Abl的形成是导致慢性粒细胞白血病（CML）发病的根本原因，靶向抑制Bcr-Abl是治疗CML的关键。Bcr-Abl基因点突变是导致临床靶向药物耐药的主要原因。目前认为去乙酰化酶抑制剂通过上调组蛋白的乙酰化水平而使基因处于松散状态而利于基因的表达，因此本项目的思路为：使用去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）来筛选能靶向Bcr-Abl的microRNA。在项目申报的前期工作中，通过表达芯片和在线预测软件筛选到miR-4649可能靶向于Bcr-Abl。但是经后续研究发现，转染miR-4649并不能下调Bcr-Abl和抑制CML细胞的增殖。因此，本着实事求是的原则对后续实验进行了调整，即使用定量PCR和细胞转染实验并结合在线预测软件继续筛选可能靶向Bcr-Abl的microRNAs。结果筛选到可能靶向Bcr-Abl的microRNAs，包括miR-5195，miR-194，miR-192，miR-6816，miR-4786，miR-4505，miR-4433，即SAHA能上调这些microRNAs的表达，同时转染这些microRNAs能下调Bcr-Abl的mRNA水平。因时间和实验限制，仅选取部分microRNA开展后续实验，其中转染miR-4786，miR-4505，miR-4433均能诱导CML细胞K562的凋亡，并抑制Bcr-Abl蛋白及其下游信号通路。在293T细胞中证明了Bcr-Abl为miR-4786，miR-4505，miR-4433的直接作用靶点。使用病毒过表达miR-4433能下调CML细胞K562的Bcr-Abl水平并抑制其下游信号通路，及抑制K562细胞在体内和体外的增殖。在临床转化研究中，miR-4433的表达水平较正常人并没有明显降低，但SAHA能上调CML病人的miR-4433的表达，同时也能下调Bcr-Abl的水平，使用病毒过表达miR-4433也能下调Bcr-Abl的水平。. 本项目探明了SAHA通过microRNA的调控并靶向于Bcr-Abl并抑制其下游信号通路，进而抑制CML细胞的增殖，促进细胞凋亡。从microRNA的表观调控角度证明了SAHA抑制Bcr-Abl并诱导细胞凋亡的分子机理，为SAHA用于治疗CML的潜在应用提供依据。