桑叶DNJ类多羟基生物碱生物合成关键酶基因挖掘和功能研究

DNJ polyhydroxy alkaloids are powerful α-glycosidase inhibitors, and their unique structure and significant pharmacological activities are attracting much attention. However, the study of biosynthesis pathway and key enzyme genes has not been reported. Based on previous researches, we suggest the possible biosynthesis pathway of DNJ polyhydroxy alkaloids in mulberry leaves. Firstly, the L-lysine is catalyzed by lysine decarboxylase (LDC) to produce 1,5-diaminopentane. Subsequently, a molecule of NH2 is removed by copper amine oxidase (CAO) into 5-aminopentanal and △1-peperidimium. Finally, the DNJ polyhydroxy alkaloids are produced by CYP450 hydroxylase or methylase. Based on this hypothesis, this project aims to screen the candidate genes of polyhydroxy alkaloids biosynthesis pathway by comparing transcriptome and qRT-PCR data analysis. Cloning, expression and bioinformatics analysis of key enzyme candidate genes will be studied. Then, we will identify the catalytic activity through enzymatic reaction in vitro and study the function by gene over-expression and RNA interference in vivo on the basis of constructing agrobacterium mediated genetic transformation system. Finally, we wish to obtain the key enzyme genes of DNJ polyhydroxy alkaloids biosynthesis in mulberry leaves. What’s more, it will lay a foundation for analysis of the biosynthetic pathway and its production with synthetic biological strategy.

桑叶DNJ类多羟基生物碱属于强效α-糖苷酶抑制剂，具有独特结构和显著的药理活性。但其生物合成途径及关键酶基因的研究尚未见报道。本项目在前期研究工作基础上，提出桑叶DNJ类多羟基生物碱可能合成途径：DNJ类多羟基生物碱，首先是L-赖氨酸被赖氨酸脱羧酶催化脱羧产生1,5-戊二胺，随后在铜胺氧化酶作用下脱去一分子NH2生成5-氨基戊醛和1-哌啶烯，再经过CYP450羟化酶或甲基化酶等作用生成。基于该假说本项目通过比较转录组学，结合qRT-PCR数据分析，筛选DNJ类生物碱生物合成途径关键酶候选基因；采用分子克隆技术对关键酶候选基因进行克隆、表达；采用体外酶促反应分析其体外功能；构建发根农杆菌介导桑遗传转化体系，采用基因过表达技术和RNA干扰技术研究其体内功能。通过本项目研究，最终获得DNJ类多羟基生物碱生物合成关键酶基因，并为解析桑叶DNJ类多羟基生物碱生源途径，实现合成生物学生产奠定基础。

桑叶DNJ类多羟基生物碱属于强效α-糖苷酶抑制剂，具有独特结构和显著的药理活性。但其生物合成途径及关键酶基因的研究尚未见报道。本项目在前期研究工作基础上，提出桑叶DNJ类多羟基生物碱可能合成途径：DNJ类多羟基生物碱，首先是L-赖氨酸被赖氨酸脱羧酶催化脱羧产生1,5-戊二胺，随后在铜胺氧化酶作用下脱去一分子NH2生成5-氨基戊醛和1-哌啶烯，再经过CYP450羟化酶或甲基化酶等作用生成。基于该假说本项目通过比较转录组学，利用不同生长时期桑叶中差异基因表达水平与DNJ含量的相关性分析，筛选DNJ生物合成途径关键赖氨酸脱羧酶LDC、铜胺氧化酶CAO、还原酶SDRs/P5CRs及甲基转移酶MTs和CYP450羟化酶等关键酶候选基因。对候选基因进行了克隆、表达和体外功能验证，结果显示MaLDC蛋白能够催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺，MaCAO蛋白能够催化1,5-戊二胺形成5-氨基戊醛，MaSDR1/MaSDR2、MaP5CR1蛋白能够催化Δ1-哌啶烯生成哌啶，MaMT1蛋白能够催化哌啶形成2-甲基哌啶。桑的农杆菌介导的过表达遗传转化体系和病毒诱导的基因沉默转化体系进一步验证了上述关键酶基因对桑叶中DNJ的生物合成具有调控作用。本项目研究成果揭示了桑叶DNJ生物合成从赖氨酸到2-甲基哌啶的生物学过程，即赖氨酸经MaLDC作用下脱羧产生尸胺，尸胺经MaCAO氧化脱氨基后形成5-氨基戊醛，之后自动环化形成Δ1-哌啶烯，Δ1-哌啶烯经MaSDRs/MaP5CR1还原后形成哌啶，哌啶在MaMT1作用下形成2-甲基哌啶。并在此基础上推测了DNJ是在2-甲基哌啶结构上通过CYP450羟基酶的立体选择性修饰形成，为完整解析桑叶中DNJ类多羟基生物碱生物合成途径，实现合成生物学生产奠定基础。本项目发表论文13篇，其中 SCI 收录9篇；培养博士毕业生3名，在读博士生1名，硕士生1名。