海南粗榧抗癌三尖杉酯类生物碱合成酶基因的挖掘

C.hainanesis is a relic plant of genus Cephalotaxus,family Cephalotaxaceae, which has been listed as endangered species under second-grade state protection. Plant in this genus is with unique secondary metabolites, cephalotaxine and its derivatives. Among the derivatives, cephalotaxus ester alkaloids are with anticancer activity which have been successfully applied in cancer therapy. However, the genes involved in enzymatic synthesis these alkaloids are not revealed at all, in turn, it remains as a bottleneck of producing these alkaloids with genetic engineering. This project will take different tissues and cell cultures as materials, first, methods for enhancing alkaloids content by eliciting will be screened. Then, both materials before and after eliciting with the alkaloid content (determined by LC-MS)as phenotypes will be used for transcriptional sequencing and differentially expressed genes will be selected. Further, comparative proteomics analysis will be carried on to select candidate genes. Last, candidate genes will be verified by RNAi to confirm which is responsible for the biosynthesis. This project will gain some key genes prospectively and can answer the following questions: (1) whether biosynthesis of cephalotaxus ester alkaloids is a result of response to bio/abiotic stress? (2) which gene is rate-limiting enzyme gene in the metabolite pathway. This project will contribute to synthesize the alkaloids by artificial induction techs and genetic engineering.

海南粗榧为三尖杉科三尖杉属一种残遗植物，为国家二级濒危重点保护植物。该属植物特有一类次生代谢产物“三尖杉碱及衍生物”。衍生物中的三尖杉酯类碱具有抗癌活性，已成功应用于多种癌症治疗。然而，关于合成这些生物碱的基因均未被挖掘，成为基因工程技术生产该类生物碱的瓶颈。本研究拟以不同组织、细胞为材料，首先建立三尖杉酯类碱生物碱人工诱导提高含量的方法，并根据诱导前后生物碱含量（LC-MS法测定）为表型，进行比较转录组分析，寻找差异表达基因群；进一步结合比较蛋白质组分析结果，关联分析确定候选基因。最后，通过RNAi技术验证哪些基因参与了三尖杉酯类碱的生物合成。预期本研究可以获得5-10个三尖杉酯类生物碱合成的酶基因，并且回答如下问题：（1）人工诱导三尖杉酯类碱合成的分子机制。（2）三尖杉酯类生物碱生物合成过程中，哪些基因为关键酶基因。本研究将为人工诱导合成和基因工程技术生产三尖杉酯类生物碱奠定基础。

海南粗榧为三尖杉科三尖杉属一种残遗植物，为国家二级濒危重点保护植物。该属植物特有一类次生代谢产物“三尖杉碱及衍生物”。衍生物中的三尖杉酯类碱具有抗癌活性，已成功应用于多种癌症治疗。但关于合成这些生物碱的基因均未被挖掘，成为基因工程技术生产该类生物碱的瓶颈。本研究建立了三尖杉酯类生物碱的测定法，获得了海南粗榧基因信息的蓝图，获得了大量三尖杉酯类生物碱生物合成相关基因，推测的三尖杉酯类生物碱生物合成的上游通路。研究了该类型生物碱的诱导合成规律。取得以下成果：（1）建立了三尖杉碱及其衍生物总碱含量的测定方法。（2）利用GC-MS和UPLC分别建立一种同时测定三尖杉碱、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱3种化合物含量的检测方法。分析了海南粗榧叶片、枝条和树皮中3种生物碱的代谢分布。（3）用根、茎、叶混合样品作为材料，实施了全长转录组测序。共获得18.17GB原始碱基数据，共成功匹配基因数量为173917条。获得了三尖杉碱上游通路代谢产物多巴胺、4-羟基苯丙醛生物合成候选基因。（4）在前期全长转录组数据库中筛选得到9个常用内参基因，最终确定18s在各种处理条件下表达最为稳定。为进一步研究胁迫诱导相关基因鉴定了基础。（5）以正常生长的和茉莉酸甲酯诱导后的叶片为材料，通过比较转录组、蛋白质组研究，推导获得了三尖杉碱酯化形成三尖杉酯类生物碱过程中酯链合成的候选基因。（6）根据全长转录组结果筛选的基因，解析了三尖杉碱合成上游通路，并利用原核表达体系和真核表达体系验证了酶的催化功能。获得了催化合成三尖杉碱起始化合物的候选基因，初步验证了其催化活性。亚细胞定位表明该酶定位在细胞质中。（7）研究了通过外源刺激提高三尖杉酯类生物碱含量的方法，发现了三尖杉碱向三尖杉酯类生物碱转化的规律。以上结果为进一步挖掘、筛选、验证等的深入研究提供了强力的数据支持，为人工诱导合成和基因工程技术生产三尖杉酯类生物碱奠定基础。