喜树碱生物合成关键酶基因CaSTR的挖掘与功能研究

Plant-derived camptothecin-type(CPT) drugs are widely used in clinical nowadays. Recent datas indicated that at least two routes sharing common intermediate “stirctosidine” for CPT biosynthesis have evolved in plants, a “Gentianales-type” pathway and a novel one named “Cornales-type”. A series of subsequent enzymatic catalyzed steps in Camptotheca acuminata remain poorly understood. Thus the cloning and characterization of the missing CaSTRs is of vital importance for a more complete picture of CPT biosynthesis. Phytometa resource metabolite database was constructed and pre-performed gene mining and cloning yeilded five STR candidates. A multi-platform approach incorporating different analytical methods to continously examine different CPT-accumulating tissue is applied to tracing the accumulation characteristics of the key intermediates involved in CPT biosynthesis. Meanwhile, potential STR gene candidates are screened by a homology-based mining of multi-libraries and cloned by RT-PCR and RACE. Coupled with extensive metabolomics resources analysis, STR candidates are prioritized by expression pattern and phylogenetic analysis for further functional characterization in vitro. This enabled a more complete picture of CPT biosynthesis and herein provied essential information for subsequent enzymatic catalyzed steps occurring in Camptotheca acuminata.

目前临床使用的喜树碱类抗肿瘤药物原料药喜树碱主要源自于植物。喜树碱类化合物的生物合成有“Gentianales-type”和“Cornales-type”两种途径的可能，但关键中间体均为异胡豆苷（ST），ST的后续步骤尚待阐明。故喜树中ST合成酶CaSTR的克隆及功能阐释是全面揭示喜树碱生物合成的关键，为此我们构建了植物代谢成分数据库，挖掘了候选基因CaSTR 9条，克隆5条全长序列。本项目拟在此基础上，应用色谱-波谱联用技术，追踪关键中间体积累模式；基于序列同源性，从转录组数据库中挖掘和筛选关键CaSTR候选基因；通过基因结构分析结合RACE技术进行关键候选基因的全长克隆，进而构建关键候选基因表达模式；整合喜树碱生物合成中间体的积累模式、关键候选基因表达模式以及候选基因结构特征，优选候选基因，进而进行体外异源表达和功能验证。旨在为全面阐明喜树碱的生物合成提供基础。

喜树碱（CPT）生物合成的关键步骤有“Gentianales-type”和“Cornales-type”两种假说，两种途径推测的关键中间体分别为异胡豆苷和异胡豆苷酸，而催化此步骤的功能基因的解析长期处于停滞状态。由此喜树中异胡豆苷合成酶候选基因（CaSTR）的挖掘与功能解析是全面揭示CPT生物合成的关键。.为此我们构建了源自43种产CPT植物的代谢物In-house SCAU-Phytometa Resource数据库，库容487。采集一个完整自然年的喜树花、果、茎、叶样品，并进行总生物碱提取工艺优化与CPT和HCPT含量测定。构建CPT和HCPT在不同时期不同部位中的积累规律，并确定7-8月为CPT合成代谢旺盛期。基于UPLC-MS/MS技术对喜树花、果、茎、叶代表性样品进行靶向代谢组学分析，根据诊断离子与质谱裂解规律，从中发掘并鉴定隶属于5个结构类别共33种CPT衍生物及其合成前体。根据化学反应合理性及其相对含量，构建现有最为完整的CPT下游合成途径及中间体富集规律，从化学角度确定CPT生物合成关键中间体为异胡豆苷酸，而不是异胡豆苷。.基于序列同源性从喜树基因资源数据库中挖掘CaSTR候选基因序列14条。STR蛋白保守序列分析、生物信息学分析、系统发育分析结果表明CaSTR可能存在不同的催化功能。结合候选基因表达分析，从中优选5条候选基因，通过密码子优化、跨膜区截短与全基因合成技术构建5条候选序列的表达载体，经表达条件优化、重组蛋白变性增溶与梯度稀释复性，成功制备5条候选序列的少量重组蛋白。利用自制混合底物完成5条重组蛋白的酶活测试，根据新增产物峰与标准品的色谱保留时间、质谱裂解规律确定CaSTR2，CaSTR11，CaSTR13重组蛋白的反应产物为strictosamide。综合喜树无菌苗对照组与AgNO3、MeJa、PEG诱导组的转录组与靶向代谢组学分析结果，最终确定CaSTR2，CaSTR11，CaSTR13具有同时催化底物Pictet-Spengler缩合和脱水缩合两步反应的双重功能，并将其命名为CaSAS1，CaSAS2，CaSAS3。.本研究通过连续靶向代谢组学方法勾勒完整的CPT下游合成途径，从14条CaSTR候选序列中确定CaSAS1，CaSAS2，CaSAS3的独特催化功能，破解了困扰多年之谜，同时为下游途径未知基因的探索与功能解析奠定了基础。