桑蚕高效富集1-脱氧野尻霉素的机理研究

本项目在前期桑蚕研究积累的基础上，合理提出蚕体富集桑叶中1-脱氧野尻霉素（DNJ）的机理可能为家蚕体内含有一酶类物质，该酶类物质抵抗DNJ的二糖酶抑制性，不使DNJ与二糖酶作用在体内转化吸收，从而使DNJ在蚕体内高效富集的工作假说。基于该假说，本项目在已优选出高DNJ含量的桑种资源基础上，采用蛋白质双向电泳、RNA差减杂交、RT-PCR、杆状病毒表达系统与转基因等分子生物学方法和技术手段研究家蚕体内与富集DNJ相关酶类物质及其基因，阐明家蚕体内富集DNJ的分子机制；并以此选育能够高效富集DNJ的优良蚕品种资源，以期提供利用家蚕天然生物反应器高效获得DNJ的新途径，为桑蚕资源的深度开发利用开拓新的方法和技术手段。

本项目在优选出高DNJ含量的桑种资源基础上，采用蛋白质双向电泳、差减杂交技术、RT-PCR等分子生物学方法和技术研究了家蚕体内与富集DNJ相关酶类物质及其基因，阐明家蚕体内富集DNJ的分子机制；以此为选育能够高效富集表达DNJ的优良蚕种资源，利用家蚕这种天然生物反应器高效获得DNJ活性物质的新途径，为开发新的降血糖、抗病毒等药物提供了基础研究。项目主要完成研究工作及阶段性成果如下：.　　1、研究了家蚕不同生长期蚕体及其代谢副产物中DNJ的含量的变化规律。揭示了家蚕生长过程存在其独特的DNJ代谢规律，且与食桑量相关，对这一代谢规律的研究，将有利于我们综合利用家蚕及其副产物资源。. 2、研究了1-脱氧野尻霉素在家蚕体内富集分布规律及与食桑量的相关性。发现家蚕幼虫期蚕体及其副产物中DNJ总累积量与其在该阶段所食桑叶中DNJ总量相当，且不同组织器官中DNJ含量差异较大，蚕血中最高。本研究结果为进一步研究家蚕富集DNJ的机制提供了理论依据。.　　3、研究了不同家蚕体内DNJ含量与二糖酶的关系。测定了不同品种家蚕体内DNJ含量并研究其与二糖酶的关系，结果表明，家蚕体DNJ含量与蚕体内的蔗糖酶、乳糖酶等二糖酶活力呈负相关，与淀粉酶的活力相关性较小。这为DNJ作为α－糖苷酶抑制剂具有降血糖作用但无产气等副作用提供了理论依据。.　　4、构建了家蚕体DNJ含量差异较大的组织间抑制性消减杂交 cDNA 文库，从构建的cDNA文库随机挑选出40个阳性克隆进行测序，通过BLAST比对，得出包括碱性丝氨酸蛋白酶等在内的8种蛋白，对消减文库中的差异表达基因进行半定量 RT-PCR 分析，研究推测出三种酶可能与DNJ富集相关。为深入探讨其富集机制提供依据。.　　5、采用蛋白双向电泳及质谱分析技术对家蚕富集DNJ的相关酶物质进行探索性研究，鉴定出9个特异蛋白，且推测与DNJ富集相关。.　　6、采用RT-PCR技术，对抵抗DNJ的二糖酶抑制性相关基因的进行了功能验证。检测获得的不同DNJ含量家蚕品种中，编码30K和GST蛋白的基因表达差异与DNJ含量相关。.　　研究工作在国内外学术期刊发表论文13篇，其中SCI收录4篇；待发表论文3篇；获授权发明专利2项；培养硕士研究生4名，博士生1名。