甾体生物碱贝母辛生物合成途径关键酶基因的挖掘与验证

Fritillaria cirrhosa is a well-known Chinese herbal medicine used as an antitussive and expectorant. Peimisine is one of the major bioactive components that are responsible for the therapeutic effects. Previous pharmacological investigations have indicated that peimisine had been shown to be beneficial antitumor effects, suggesting that it is a potential drug. Unfortunately, content of peimisine is very low. Isosteroidal alkaloids are fairly complex alkaloids comprised of six rings, including basic nitrogen, in the steroid molecule. And the difficulties in separation and chemical synthesis impeded the progress of research of peimisine. We have deduced a biosynthetic pathway of peimisine according to the difference between cycloartenol with steroidal alkaloids and found that CYP450s might be responsible for catalyzing these reactions. In our study, the difference of gene expression will be analysized in different tissue by RNA-seq, to reveal coexpression with CAS and CYP450s. The gene coexpression will be assessed by real-time PCR. And these enzymes will be expressed in Saccharomyces cerevisiae. We will analyze target produces by LC-MS /MS. The implementation of the project will provide opportunities for enhancing the contents of isosteroidal alkaloids. This study will provide an important clue for the biosynthesis of other Traditional Chinese Medicine.

甾体生物碱贝母辛是“止咳圣药”川贝母的主要活性成分之一，药理研究发现其对肺癌细胞增殖有很好的抑制效果，是极具开发潜力的先导化合物。然而贝母辛含量很低，结构复杂，难以通过化学分离或合成方法大量获得，严重制约了其开发及应用。本项目组比较了川贝母中已分离到的生物碱与前体环阿屯醇的结构，推测了贝母辛的生物合成途径，发现细胞色素P450可能是该途径中的主要修饰酶。基于参与同一代谢途径的酶会共表达的理论，本项目拟通过RNA-seq技术对川贝母不同组织中的基因表达差异进行分析，筛选与环阿屯醇合成酶基因共表达的细胞色素P450基因，并通过real-timePCR对共表达进行验证。然后将筛选出的细胞色素P450基因转入酿酒酵母中进行表达，利用LC-MS/MS对酶促产物进行分析完成酶的功能验证。该项目为进一步提高贝母辛含量奠定基础，为含甾体类等结构复杂含量低的中药成分的研究开辟了新途径，具有很好的示范意义。

甾体生物碱贝母辛是“止咳圣药”川贝母的主要活性成分之一，药理研究发现其对肺癌细胞增殖有很好的抑制效果，是极具开发潜力的先导化合物。然而贝母辛含量很低，结构复杂 ，难以通过化学分离或合成方法大量获得，严重制约了其开发与应用。本项目组通过比较母核环阿屯醇与川贝母中已分离到的生物碱的结构，推测了贝母辛可能的生物合成途径，并利用PacBio SMRT单分子实时测序技术进行川贝母全长转录组测序，使用5个cells获得了10.65 Gb clean data的数据。利用SMRT Analysis软件的RS_IsoSeq模块对全长序列进行聚类分析，共得到50,523 条一致性转录本序列，使用非全长序列校正后得到41,230条高质量全长转录本序列。同时采用Illumina RNA-seq测序数据校正9,293条低质量的序列，并使用CD-HIT对各个样品的高质量序列和校正后的低质量序列去冗余，最终得到去冗余的41,809条转录本序列。鉴于同一代谢途径中的酶多会共表达，本研究通过RNA-se q技术对川贝母不同组织中的基因表达差异进行分析，筛选出与环阿屯醇合成酶基因共表达的细胞色素P450基因，并通过real-time PCR对共表达进行验证。然后将筛选出的3个细胞色素P450 基因分别转入酿酒酵母中进行表达，成功完成了2个基因的克隆和异源表达，利用LC-MS/MS对酶促产物进行分析完成酶的功能验证。该项目为进一步提高贝母辛含量奠定了基础，为含甾体类等结构复杂含量低的中药成分的研究开辟了 新途径，具有很好的示范意义。