应用单分子技术研究细胞膜微区调节水通道蛋白活性的机制

Aquaporins, which facilitate the diffusion of water across biological membranes and maintain the physiological activities of cells, are key molecules in the regulation of water transport at the cell and organ levels. However, most earlier studies focused on the responds of aquaporin to osmotic stress to regulate root hydraulic conductivity, few have examined its diffusion dynamics and partitioning in living cells, which is important for bridging data collected at the level of individual molecules to the physical and physiological processes. Our previous studies of aquaporin dynamics and partitioning revealed multiple modes aquaporin regulation. Based on these earlier investigations, we will investigate the mechanisms of memebrane microdomain acting on aquaproin activities in Arabidopsis. In this project, we will detect the correlation of aquaporin with the membrane microdomains in different scale. The changes of dynamic characters and partitioning of aquaporin during water stress will also be analyzed. Finally, we will further explore the function of different microdomains in regulating aquaporin activity. During the course of the investigation, some new methods and techniques including total internal reflection microscopy, fluorescence correlation spectroscopy and stimulated emission depletion will be used to determine the roles of different membrane microdomains in the early response events of plants to water stress.Taken together, the results of this study will provide new insights into the regulation mechanisms of aquaporin activities in living plant cells.

植物细胞膜上的水通道蛋白不仅有助于水分跨膜运输，更为重要的是它能快速灵敏地调节细胞的水分平衡，以便使细胞能正常进行各种生理活动。水通道蛋白活性调控机制的研究主要集中在植物水分生理的宏观层面，而对蛋白进行实时活体动态分析的研究比较匮乏。我们的研究发现，水通道蛋白在细胞膜上的动态分布与转运参与多元调控蛋白活性。根据这些前期结果，本项目将以拟南芥为材料，对不同尺度的细胞膜微区（脂筏、蛋白寡聚化形成的微区）对水通道蛋白活性的调控进行研究：(1)观测水通道蛋白定位与不同细胞膜微区的相关性；(2)研究水通道蛋白动力学特征和定位对水分胁迫的响应；(3)分析细胞膜微区在植物对水分胁迫响应的早期事件中的作用。在本项目研究中，拟采用全内反射荧光显微术、荧光相关光谱、受激发射损耗显微术等新技术，旨在揭示质膜动态结构调控水通道蛋白活性的机制，从而为进一步阐明水通道蛋白活性调控的机理提供新的依据。

植物细胞膜上的水通道蛋白能依赖渗透势高效介导水分跨膜转运，是细胞内与细胞间运输水分的主要通道，在快速维持细胞渗透平衡和调节植物生理活动中发挥重要作用。近年来，国内外有关水通道蛋白的研究主要集中在水通道蛋白特异性运输水分子的机理，以及在环境胁迫下水通道蛋白的功能等相关信息，而对蛋白进行实时活体动态分析的研究比较匮乏。因此，在高空间、时间分辨率尺度上，探测生命活动的单个、相对独立的早期事件，成为生命研究中亟待解决的问题。本项目在我们前期研究的基础上，以拟南芥为材料，通过遗传转化，获得了荧光蛋白标记质膜蛋白的材料。在此基础上，对质膜定位蛋白活性的调控机制进行了研究。首先，分析了翻译后修饰对水通道蛋白在细胞膜上的精准定位和亚细胞循环的调控，结果显示磷酸化状态对水通道蛋白的动力学参数和胞内循环中的内吞途径都密切相关；其次，以叶表皮保卫细胞为研究体系，研究了水通道蛋白对水分胁迫的应答过程中的动力学特征；此外，质膜蛋白相互作用形成的复合体对水通道蛋白参与不同的生理功能具有重要调控作用，本项目对参与形成水通道蛋白功能复合体的质膜蛋白H+-ATPase和磷脂酶D在应答环境胁迫的早期事件中的特征，进行了高时空分辨率的动态研究。在本项目研究过程中，采用了全内反射荧光显微术、荧光相关光谱、光转换荧光蛋白等新的技术与方法。同时，根据植物细胞独特的化学组分导致的荧光谱图的偏移，利用Matlab编写适合追踪分析植物材料单分子图像的算法和自动化程序，推动了植物膜蛋白复杂动态特征的单分子水平分析的发展。这一项目研究的开展，为进一步阐明水通道蛋白活性调控的机理提供新的依据和技术手段。