青风藤配伍附子活性成分对破骨细胞生成的影响和分子免疫机制研究

破骨细胞过度生成是引起RA骨破坏的重要因素，与免疫激活密切相关。青风藤和附子是中医治疗RA的常用配伍药物，是抗RA复方青附关舒的主成分，但是二者的重要活性成分单独和配伍使用对破骨细胞生成的影响未见报道。为此，本研究采用RANKL和M-CSF刺激多种RA相关前体细胞，检测与破骨细胞生成和破骨活性有关的基因和核转录因子的表达，观察两种中药的活性成分青风藤碱和乌头类生物碱单用和配伍使用对破骨细胞生成的直接作用；同时，研究它们对骨免疫学通路上的重要因子RANKL、OPG表达的影响，以及对调节性T细胞（Treg）抑制破骨细胞生成的影响，探讨药物对破骨细胞生成的间接作用。最后，用RA动物模型从骨免疫学角度将配伍的结果进一步验证。本研究从与RA密切相关的破骨细胞和骨免疫学角度，探索抗风湿复方中青风藤配伍附子对骨破坏的可能影响和分子免疫机制，对于药物的研发和中药复方配伍在临床中的应用，都具有重要的意义。

骨破坏是类风湿性关节炎（RA）的重要表现，严重的甚至造成残障，但目前没有能够较好地阻止骨破坏进展的药物。破骨细胞过度激活是引起RA骨破坏的重要因素。青风藤和附子是中医药治疗RA的常用植物药，常配伍使用，但两药单独或配伍使用能否抑制破骨细胞发挥作用均未见报道。两药的主要成分明确，我们用其反映两药的活性，开展了四个方面的研究：(1) 首先分析青风藤中的重要活性成分青藤碱单独使用对破骨细胞的影响：发现青藤碱能够显著地抑制RANKL、LPS 等不同激活剂诱导的破骨细胞生成和骨吸收。进一步机制研究表明，青藤碱能明显下调TRAF6/c-Src或TLR4/TRAF6，降低激活的NF-κB、NF-AT、AP-1核因子转录，抑制Ca2+离子内流 ，抑制TRACP、Fra-1、Fra-2等破骨相关基因表达，影响MAPKs （P-38、JNK）磷酸化，从而影响破骨细胞的生成和活性；还能升高Caspase-3增加破骨细胞凋亡，抑制破骨细胞存活。在体内，青藤碱能够降低RANKL/OPG比值，显著降低Mt诱发的关节炎大鼠骨吸收；明显改善LPS诱导的小鼠颅骨破坏。（2）附子活性成分乌头碱生物碱（乌头碱、苯甲酰乌头碱、乌头原碱）单独使用对破骨细胞生成的影响： 发现附子活性成分乌头碱、乌头原碱能够抑制体外破骨细胞生成，苯甲酰乌头碱无显著作用；3个成分仅能微弱抑制NF-κB入核，其中乌头原碱能够剂量依赖性抑制破骨前体细胞NF-κB-luc转录。 (3) 两药活性成分配伍对破骨细胞的影响：发现附子活性成分乌头碱和乌头原碱能增强青藤碱对破骨细胞的抑制作用，而苯甲酰乌头碱无影响。（4）两药配伍对破骨细胞生成的间接影响： 发现青藤碱能抑制anti-CD3激活的CD4+T细胞RANKL 表达，而乌头原碱对其抑制活性有促进作用; 由于RANKL是重要的破骨细胞生成因子，提示两药也可能通过影响其他免疫细胞，间接减弱破骨细胞生成。研究从破骨细胞角度发现了传统中药青风藤、附子单独和配伍抗风湿治疗RA的新机制，并多角度深入阐述了其活性成分的相关分子免疫机制；此外，结果还提示附子久煎有益于其发挥抗破骨细胞活性，为两药进一步研究应用提供基础。研究已发表SCI论文3篇，其它论文多篇。