植物水通道蛋白活性调控机制的活体动态研究

位于生物膜上的水通道蛋白不仅有助于水分跨膜运输，更为重要的是它能快速灵敏地调节细胞内与细胞间的水分流动，维持植物体内水分平衡，以便使细胞能正常进行各种生理活动。近年来，国内外有关水通道蛋白的研究一直是植物与水分关系研究的重点和热门课题，然而目前的研究主要集中在水通道蛋白特异性运输水分子的机理，以及在环境胁迫下水通道蛋白的功能等方面；而水通道蛋白活性的调控机理尚不十分清楚，特别是在单分子水平上对质膜水通道蛋白进行实时活体动态分析的研究比较匮乏。本项目拟以模式植物拟南芥为材料，通过隐失波显微术、原子力显微术和非损伤微测等先进技术，结合新型荧光标记物- - 量子点和单颗粒追踪分析等方法，对翻译后蛋白的修饰、蛋白异聚化和胞内膜运输对水通道蛋白活性的调控进行系统研究，在单分子水平揭示植物水通道蛋白活性的调控机制，从而为进一步阐明水通道蛋白活性调控的机理提供新的依据和研究思路。

目前已有研究者开始关注模式植物拟南芥活细胞内水通道蛋白的亚细胞循环，但是对其掩藏于宏观研究之下的蛋白动力学特征和异质微环境却知之甚少。本课题在单分子水平上对拟南芥细胞膜水通道蛋白PIP2;1的动态特征和内吞途径进行了研究。.荧光定位检测显示FP标记并未影响PIP2;1的质膜定位。爪蟾卵母细胞的渗透性数据显示，GFP-PIP2;1融合蛋白仍然具有水分运输通道的功能。应用隐失波显微术在完整植株中开展了PIP2;1蛋白寡聚状态的分析。结合荧光强度统计和漂白步数分析，研究结果显示，PIP2;1可以在细胞质膜上以四聚体状态存在，但是并未完全排除单体、二聚体和三聚体的存在。.EWM观察表明，GFP-PIP2;1分子在细胞质膜上呈现侧向位移的动态，对活细胞质膜上GFP-PIP2;1的动力学特征进行分析，以及单颗粒示踪分析，结果发现PIP2;1在细胞质膜上存在多种运动模式，而且扩散系数分布范围较广。更为重要的是，该蛋白可以通过侧向运动进入/离开特定的质膜微区，从而证实PIP2;1在细胞质膜上的运动和分布具有非均一性的特点。.应用固醇抽提试剂 (methyl-β-cyclodextrin, MβCD) 处理拟南芥幼苗，EWM的观察发现，MβCD导致GFP-PIP2;1在质膜上的分布发生显著变化。为进一步确定PIP2;1与膜筏的关系，在拟南芥中共转化膜筏标识蛋白mCherry-Flot1和GFP-PIP2;1，经共定位分析显示，质膜上部分PIP2;1分子和Flot存在共定位，说明部分GFP-PIP2;1定位在膜筏上。为深入研究PIP2;1的内吞途径，分别对clathrin-依赖和raft-相关两条内吞途径的标识性蛋白 (mCherry-CLC、mCherry-Flot1) 与PIP2;1的相关性进行分析。结果表明，正常条件下干扰clathrin-依赖途径显著抑制PIP2;1的内吞，而干扰raft-相关途径对PIP2;1的内吞影响不大；在高渗条件下，干扰两条途径均显著抑制了PIP2;1的内吞。.综上所述，借助于高时空分辨率的成像技术和光谱技术，本研究首次在植物活细胞中，实现了在单分子水平上分析单个蛋白的分布、聚合状态、内吞过程及其调控之间的联系，从而进一步揭示了不同内吞途径参与多元调控PIP2;1蛋白活性的新机制。