钙通道的钙调蛋白依赖性易化与失活的分子机制

钙调蛋白（CaM）依赖性易化与失活是我们最近提出的新概念，它与经典的钙离子（Ca2+）依赖性易化与失活一起构成了钙通道调节的两个正负反馈机制系统。关于两者的关系，我们提出了两者间相互影响，而CaM依赖性易化与失活机制可能更为基本的新观点。CaM蛋白呈哑铃型构象，由氨基端的N环、羧基端的C环和两环间的连接三个部分组成，N、C环上各有亲和力不同的两个Ca2+结合位点。本研究拟采用分子生物学手段及膜片钳制技术开展如下研究：（1）观察CaM半剪切体及Ca2+结合位点点突变体对钙通道活性的易化与失活作用及其Ca2+浓度依赖性；（2）观察各CaM与通道蛋白的结合关系及其Ca2+浓度依赖性；（3）各条件下钙通道活性及蛋白结合量与[CaM]及[Ca2+]三维量效关系的数学模拟。通过探讨CaM的 N环、C环及其连接部在CaM依赖性易化与失活中的不同作用，明确CaM引起钙通道活性易化与失活的分子机制。

Calmodulin（CaM，钙调蛋白）通过与钙离子（Ca2+）结合介导了钙通道的Ca2+（CaM）依赖性易化与Ca2+（CaM）依赖性失活过程，形成了钙通道特有的正负反馈调节机制。本项目探讨了该过程的分子机制，结果如下。（1）采用重组GST融合蛋白技术，建立了大量纯化具有生物活性的CaM及其Ca2+结合位点突变体CaM12、CaM34、CaM1234蛋白的方法。（2）采用半定量GST pull-down assay法和结合量曲线拟合，研究了CaM及其突变体与Cav1.2的C末端蛋白CT1的结合，发现CaM和CaM12与CT1的结合具有浓度依赖性和[Ca2+]依赖性；在高[Ca2+]下，CT1可以结合约两分子的CaM。CaM34和CaM1234与CT1结合时，[Ca2+]依赖性消失，提示CaM的C-lobe起着更为重要的作用。（3）CaM及其突变体也可以与Cav1.2的N末端结合，当[Ca2+]升高至10 μM和2 mM时，CaM与NT结合较明显。（4）CaM半剪切体（N-lobe或C-lobe）均可单独与Cav1.2的C末端结合，而且均存在[Ca2+]依赖性。C-lobe较N-lobe有更高的结合量。（5）CaM半剪切及其突变体均可以与IQ和preIQ基序结合，C-lobe与IQ及preIQ的结合量高于N-lobe的结合量。有趣的是C-lobe与preIQ的结合发生在较高[Ca2+]条件下。（6）CaM的N-lobe和C-lobe均可以与Cav1.2的N末端（NT）结合，结合量随[Ca2+]的增加而增加。C-lobe与NT的结合也需要较高的[Ca2+]。结论：在低和中等[Ca2+]时，Cav1.2可能只能结合一个CaM分子；随着[Ca2+]升高，结合量增加，这可能是通道活性易化的基础；当[Ca2+]进一步升高，或CaM浓度升高时，Cav1.2的C末端可以结合两个分子的CaM，这可能与通道的失活机制相关；CaM与Cav1.2钙通道可以同时形成的N-lobe与Cav1.2的NT，C-lobe与 Cav1.2的 CT，或C-lobe与Cav1.2的NT，N-lobe与 Cav1.2的CT结合的架桥式构型，为Ca2+（CaM）依赖性失活提供了结构基础。研究共发表论文43篇，其中SCI论文10篇，优秀论文奖7篇。培养博士研究生5人，硕士研究生3人，完成了预期目标。