半乳凝素1介导的骨髓间充质干细胞调控系统性红斑狼疮T细胞异常增殖的机制研究

Systemic lupus erythematosus is one of the most common autoimmune diseases, stem cell therapy of SLE is currently the most popular research subject. Our previous studies demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSC) provided significant improvement to SLE disease, by acting on over-proliferation of lymphocytes, however the exact mechanism remains unclear. As a novel immunoregulatory molecule, Galectin-1 correlates closely with immunomodulatory effect of BMMSC, thus we speculate that galectin-1 may mediate BMMSC's effect on SLE T cell. To investigate the mechanism of BMMSC inhibiting abnormal proliferation of T cell from lupus via galectin-1, this project is about to analyze the galectin-1 expression on BMMSC of different sources and the correlation with SLE Disease Activity Index. We will also compare the therapeutical effect of wide-type and Gal1-/- murine BMMSC on lupus mice, and evaluate the T cell proliferation and Treg differentiation. Additionally, though establishment of co-culture system of BMMSC and T cell, we expect to identify the regulatory role of galectin-1 on BMMSC function, and expound that galectin-1 mediate BMMSC's suppression on abnormal T cell proliferation via Ras/Raf/MEK/ERK signaling. This research will provide solid theoretic foundation for BMMSC's clinical application to treat SLE.

SLE是最常见的自身免疫性疾病，干细胞治疗是目前最受关注的研究。我们前期研究证实骨髓间充质干细胞(BMMSC)能改善SLE病情，其治疗靶点在调控T细胞异常增殖，但确切机制不明。新兴的免疫调节分子-半乳凝素1与BMMSC的免疫调节作用密切相关，可能是介导BMMSC作用于SLE T细胞的新介质。为探索半乳凝素1介导BMMSC对SLE T细胞的作用机制，本课题拟分析不同来源BMMSC中半乳凝素1的表达与SLE病情的相关性；使用正常鼠和半乳凝素1基因敲除鼠的BMMSC治疗狼疮鼠，比较病情改善情况及T细胞增殖、Treg细胞分化情况；并通过建立BMMSC与T细胞的共培养体系，证实BMMSC分泌的半乳凝素1对SLE异常增殖T细胞的调控作用，揭示半乳凝素1通过调节T细胞Ras/Raf/MEK/ERK信号通路介导BMMSC对SLE异常增殖T细胞抑制的作用机制，为BMMSC临床治疗SLE提供充分的理论依据。

SLE是最常见的自身免疫性疾病，以异常活化的自身反应性 T 细胞刺激自身反应性 B 细胞增殖，产生自身抗体，引起免疫复合物沉积并介导器官损伤为特征。临床上传统治疗方式主要是糖皮质激素和免疫抑制剂，存在继发感染、肝肾毒性等副作用，且部分患者治疗效果不佳。干细胞治疗新兴的治疗方向，具有免疫原性低、来源丰富的优势，确切机制不明。半乳凝素1是与BMMSC免疫调节机制有关的可溶性分子，但关于Galectin-1与SLE的研究非常有限，尚未明确Galectin-1是否作为介导BMMSC对SLE 淋巴细胞异常增殖的负性调控的重要因子。为探索半乳凝素1介导BMMSC对SLE淋巴细胞的作用机制，本课题拟建立健康人BMMSC与SLE患者淋巴细胞的共培养体系；明确健康人BMMSC对SLE患者淋巴细胞增殖、周期的调控作用；探讨galectin-1在BMMSC对SLE患者淋巴细胞增殖、周期的调控作用中扮演的角色。我们的研究首先成功分离正常人骨髓间充质干细胞，并对正常人BM-MSC进行表型鉴定：骨髓间充质干细胞高表达CD105、CD90、CD73、CD44、CD29，低表达CD45、CD34；与此同时，在成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养，BM-MSC成功分化为成骨细胞（茜素红染色可观察到矿化结节）和成脂肪细胞（油红染色可观察到脂滴）。之后采用密度梯度离心法从SLE患者外周血中成功分离单个核细胞PBMC，建立健康人BMMSC与SLE患者淋巴细胞的共培养体系（1:15接触法）。共培养3天和5天后，CD4+T细胞的增殖相比于单独活化组明显抑制，且细胞周期阻滞在G0/G1期，S期细胞比例下降；与此同时，抑制细胞增殖的细胞周期相关蛋白p21、p27表达上调，而促进增殖的CDK2表达下调。为了进一步明确BMMSC发挥作用的关键分子是galectin-1，我们检测共培养上清中galectin-1的水平，发现gal-1表达较单独培养组明显增加，且流式检测发现BMMSC胞内galectin-1平均荧光强度明显高于淋巴细胞，证实共培养上清中gal-1主要有BMMSC分泌。为了进一步探究gal-1作用机理，我们用si-RNA干扰敲低BMMSC的galectin-1基因（PCR及WB验证敲低成功），再与SLE的淋巴细胞共培养，结果BMMSC对CD4+T细胞增殖的抑制作用和周期的调节作用与未敲除组相比明显减弱。我们的