小麦非特异转脂蛋白TaLTP1启动子区域顺式作用元件鉴定及转录调控机制研究

Many non-specific lipid transfer protein (nsLTP) genes were found to be expressed on epidermis of plant aerial tissue, which were thought to participate multiple functions related with epidermal cells including in lipid metabolism, cuticle biosynthesis, plant growth, or biotic/abiotic stress resistance. Currently, little is known about plant differentiation of ground epidermal cells and its transcriptional regulation. Here, we attempt to analyze the cis-regulation of TaLTP1 promoter and transactivation mechanisms. Firstly, a series of TaLTP1 promoter deletion mutants are transformed into Arabidopsis for activity characterization and narrowing down the functional promoter fragments. Then, the identification of cis-elements specific to shoot epidermis will be identified by employing the bioinformatics tools, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and promoter mutatants in transgenic Arabidopsis, followed by analysis of the the cis-regulatory mode and evolutionary track. In order to demonstrate the transactivation mechanisms, the potential transcription factors will be isolated by yeast one hybrid and yeast surface display systems. The DNA binding specificity of isolated transcription factors will be analyzed by EMSA and the subcellular localization will be examined in transgenic tobacco by fusion with EGFP. By studying cis- and trans-regulation of TaLTP1, we aim to shed a light on plant transcriptional mechanisms of shoot epidermis specificity. The establishment of isolating potential transcription factors from cDNA libraries by yeast surface display could be an alternative way to yeast one hybrid system, which might be important for efficient isolation of DNA-binding proteins in future.

很多非特异性转脂蛋白（nsLTP）表达在植物地上组织表皮中，被认为参与了一系列表皮相关的生理过程。目前，对植物地上组织表皮，尤其是铺列细胞的转录调控机制的理解非常匮乏，因此本项目拟以TaLTP1 启动子为研究对象，首先进行5'端序列续减分析确定启动子功能区域，然后通过生物信息学、凝胶迁移和DNA顺序突变方法配合运用，准确鉴定功能顺式作用元件，分析顺式调节模式及其进化路径。为进一步揭示转录调控激活机制，利用酵母单杂交和酵母展示cDNA文库技术分离潜在的转录因子，研究其在烟叶中的亚细胞定位及与调控元件相互作用的机制。本研究通过阐明TaLTP1启动子针对地上组织表皮表达的转录调控机制，为进一步理解植物地上组织表皮细胞调控基因转录表达路径奠定基础。另外，利用酵母展示cDNA文库技术对与调控元件特异结合的转录因子进行筛选，将为分子生物学领域有效分离转录因子开辟新的模式方法。

为了研究TaLTP1启动子针对地上组织表皮特异表达的调控机制，本项目首先将TaLTP1启动子区域5’续减序列（-898、-725、-512bp、-400bp, -343bp, -297bp, -247bp, -147 bp，-512～82bp）连接到GUS报告基因，通过短柄草和拟南芥转基因植株进行了活性分析，确定了-400~-343 bp，-343~-298 bp和-298~-247 bp三个重要功能区段；结合利用利用凝胶电泳迁移（EMSA）和生物信息学分析，基本锁定了-380 bpGCCGCGGGC ( GGC motif)、-297bp CAACAC（CA rich motif）、-256bp CCATC repeat (CCATC motif)三个可能的关键调控元件。在此基础上，以-400bp启动子片段为背景，分别对三个调控元件进行了突变分析，结果发现，缺失任何一个调控元件都会导致表皮铺列细胞表达模式丢失，说明表皮铺列细胞表达特异性是三个调控元件共同协作的结果。对GCCGCGGGC进行单碱基突变并转基因拟南芥后发现两端反向互不GGC应是保守序列；对CCATC 元件单碱基突变进行EMSA和转基因拟南芥后发现CCATC串联效率最高，单个元件基本不起作用，而第一个C保守，第二个C突变为A后对功能影响不大，末端C同样保守，突变为G后功能消失。生物信息学同样发现CCATC 元件在很多植物转脂蛋白启动子区域均保守。将三个TaLTP在拟南芥中过量表达也同时出现了抗寒冷的功能冗余表型，验证了其功能保守性。在此基础上，通过酵母单杂交技术和酵母文库展示技术对以上三个元件进行了转录因子掉取，发现了CA motif 的结合蛋白为Myb96、Myb94, GGC box 的结合蛋白应为JAZ家族。因此，本研究不但发现了GGC和CCATC两个新的调控元件和其反式作用因子，还证明了TaLTP1 地上组织表皮特异表达模式是GGC、CCATC、CA 三个调控元件和Myb、JAZ等转录因子形成转录复合物开启转录调控的结果，为揭示植物表皮表达基因调控提供了有力证据。