基于CRISPR/Cas系统的快速检测结核分枝杆菌及其耐药性新方法的研究

The emergence of multidrug-resistant (MDR) Mycobacterium tuberculosis (MTB) seriously threatens the control of Tuberculosis. Because the conventional M. tuberculosis diagnostic procedures used in hospitals, such as the Löwenstein-Jensen culture method, are time consuming, a number of new diagnostic approaches have been developed and have brought incremental improvements in drug susceptibility testing. However, few of these approaches can solve the susceptibility testing problem perfectly. Here we present an approach based on CRISPR/Cas system to detect M. tuberculosis and the drug susceptibility. On recognition of its RNA target, activated Cas13a engages in “collateral” cleavage of nearby nontargeted RNAs. And detection of target RNA by Cas13a collateral RNA cleavage–mediated release of reporter signal. Because of its rapidity, simplicity, and relatively low cost, this method could be a rapid and reliable method for determining the drug susceptibility of M. tuberculosis.

耐多药结核的蔓延已经严重威胁了结核病的防控。临床常用的结核分枝杆菌及其药敏检测金标准方法一般耗时长达数月，而相对快速的仪器法和基因检测法，有着仪器成本高，检测覆盖面窄等限制。针对以上问题，本课题组提出了一种基于CRISPR/Cas系统的快速检测结核分枝杆菌及其耐药性的新方法。该方法利用CRISPR/Cas系统的“附带切割”能力，即当Cas13a与crRNA结合，并识别相应的结核菌特异性RNA序列之后，会激活Cas13a的RNA酶活性，能够切割体系中的RNA探针，并释放荧光，检测荧光信号即可实现对结核菌的检测。本项目首次将CRISPR/Cas系统用于结核菌的药敏检测，既可利用酶标仪进行精确定量，又可设计出试纸条，实现便携式快速定性检测。该方法的建立将会提供一种更快速、更容易使用的结核菌及其耐药检测新技术，极大地改善目前结核病耐药诊断的现状，符合国家重大需求，具有非常广阔的市场前景和社会效益。

肺结核是由结核分枝杆菌引发的肺部感染性疾病，具有很强的传染性,严重威胁人类健康。据《2021年全球结核病报告》显示，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，990万人患有结核病，对世界各国的经济和公共卫生带来了沉重的经济负担。临床常用的结核分枝杆菌及其药敏检测金标准方法一般耗时长达数月，而相对快速的仪器法和基因检测法，有着仪器成本高，检测覆盖面窄等限制。以上因素极大的阻碍了我国对结核病的有效防控。因此，开发高效、特异、便捷且成本低廉的MTB检测方法对结核病的预防和控制具有重要意义。本研究利用CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats/Cas）系统同时联合重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase Aided Amplification，RAA）建立了结核分枝杆菌特异性检测方法。该检测系统灵敏度较高，以结核分枝杆菌IS6110为靶点，CRISPR-Cas12a系统可检测到低至3.13 CFU/mL结核分枝杆菌H37Ra。以BACTCE 960为金标准，通过对504例临床样本进行检测，CRISPR/Cas12a检测技术的敏感性为0.883（0.809-0.932），特异性为0.940（0.910-0.961）。本研究建立了一种基于RAA等温扩增联合CRISPR/Cas12a系统的结核分枝杆菌快速检测技术平台，检测体系展现出较高的特异性与灵敏度，可在1.5h内完成检测过程，操作简便，对于结核分枝杆菌的快速检测和结核病的临床诊断具有重要意义。.项目研究期间，共发表论文4篇，其中SCI论文1篇， CSCD论文2篇。申请国家发明专利1项，培养硕士研究生5人。