结核分枝杆菌CRISPR系统的鉴定和功能研究

With the quick spread of various drug-resistant strains of M. tuberculosis, tuberculosis remains a global threat to public health. Emerging evidence indicated non-coding RNAs have multiple intracellular functions. Unfortunately, majority of non-coding RNAs have not been identified and functionally characterized yet in M. Tuberculosis, which greatly limits our understanding of the virulence mechanism and drug-resistance development of the pathogen. This study is to 1) explore the crRNA and protein components of CRISPR/Cas system to reveal how mature non-coding RNAs are processed and how they function in M. tuberculosis 2) evaluate the contribution of CRISPR/Cas system in bacterial virulence by assessing effect of expression and gene deletion of Cas proteins, to open up a new avenue of exploration in pathogenesis of M. tuberculosis.

随着耐药性结核分枝杆菌菌株的出现和广泛扩散，使结核病重新成为全世界公共卫生的难题之一。非编码RNA已被广泛证明具有多样的生物学功能，引起学术界的高度关注，但对结核分枝杆菌非编码RNA的系统发现、标注和功能研究还少有报道。本项目以结核分枝杆菌CRISPR系统为研究对象，开展此区域非编码RNA的生成、加工及其与CAS蛋白的协同作用机理研究，加强我们对非编码RNA在细胞内从生成到执行功能整个过程的全局性认识。同时揭示CRISPR/Cas系统与结核杆菌致病性的关系，从新的角度揭示致病机制，为结核病的诊断和治疗提供新思路和新途径。

在全球，结核病是十大死亡原因之一，也是单一感染源导致死亡的主要原因（超过艾滋病）。更为严重的是多耐药和广泛耐药结核杆菌所占的比例每一年都不断增加，结核病的治疗已面临严峻的局势。加强对结核分枝杆菌的基础研究，尤其是其致病性的研究，对于抗结核药物的研发及结核病的诊断和治疗显得尤为重要。CRISPR系统作为原核生物中的一种依赖于核酸的获得性免疫系统，近几年来相关研究迅猛发展，其不但能帮助细菌抵御外源基因入侵，用于编辑基因，还能影响病原菌毒力。本项目通过对结核分枝杆菌CRISPR/Cas系统中非编码RNA和Cas蛋白的鉴定和生物功能分析，系统阐释结核分枝杆菌CRISPR/Cas系统的生物功能和具体作用机制。通过体外分析crRNA-Cas蛋白复合物的核酸切割活性和体内各Cas蛋白基因过表达、缺失及缺失后回补对重组质粒转化效率的影响，揭示结核杆菌CRISPR/Cas系统的防御功能。通过体外构建结核分枝杆菌Cas系列蛋白的过表达、缺失及缺失后回补重组菌株，从分子、细胞和实验动物等层面系统阐释CRISPR与结核分枝杆菌细菌毒力的关系，揭示结核分枝杆菌的致病分子机理。