Kindlin-2在心脏发育中激活整合素的分子机制研究

Kindlin-2 is an important focal adhesion related protein, which have close relationship with integrin activation. Our previous research indicated that when Kindlin-2 deletion in developing cardiomyocytes significant decreased the activation of integrin, and resulted in heart developmental defects, demonstrating the essential role of Kindlin-2 in integrin activation and cardiac development. However, the mechanism in which Kindlin-2 activates integrin is not clear. To address this question, we analyzed the functional domain of Kindlin-2 and find the interaction between the PH domain of Kindlin-2 and PIP3 could be the potential mechanism to activate integrin. We have generated a Kindlin-2 K383A/K385A mutant mouse model, in which disrupt the interaction between the PH domain of Kindlin-2 and PIP3, but does not alter the expression level of Kindlin-2. We have observed the cardiac phenotype during the development. Accordingly, our hypothesis is that the activation of integrin rely on the binding of Kindlin-2 PH domain to PIP3. In this proposal, we will determine the requirement of the interaction between Kindlin-2 PH domain and PIP3 by comprehensively analyze the phenotype of Kindlin-2 K383A/K385A mutant mouse , as well as the integrin pathway.

Kindlin-2是一种与整合素激活密切相关的黏着斑蛋白。我们之前的研究发现在胚胎心肌细胞中敲除Kindlin-2会导致整合素活性明显降低，引起心脏发育异常。然而，关于Kindlin-2在心肌细胞中如何激活整合素，进而调控心脏发育的分子机制目前尚无研究涉及。根据目前的研究结果，我们提出了可能的机制：整合素的激活依赖Kindlin-2通过其PH结构域与PIP3结合，进而聚集Paxillin、ILK等蛋白形成稳定的活化整合素蛋白复合体。为了验证假说，我们构建了Kindlin-2 K383A/K385A基因突变小鼠，该突变破坏了心肌细胞Kindlin-2 PH结构域与PIP3的结合位点。我们将通过组织形态学、细胞分子生物学等手段全面分析基因突变小鼠的心脏发育情况、心肌细胞整合素激活情况、整合素蛋白复合体及其上下游通路，从而明确Kindlin-2在心脏发育中激活整合素的重要分子机制。

Kindlin-2是一种整合素相关蛋白，它能激活整合素活性，发挥各种生物学功能。我们之前的研究发现在小鼠胚胎早期敲除Kindlin-2，会导致整合素活性下降，细胞膜上局部粘着斑结构受到破坏、细胞与细胞外基质连接力下降、细胞外基质排列紊乱，最终导致小鼠胚胎因心脏破裂死亡。本课题是对之前研究的深入探讨，揭示Kindlin-2激活整合素的机制。PH结构域是Kindlin-2蛋白上的一个特殊结构域，细胞实验显示它能够与PIP3结合，聚集Paxillin、ILK等蛋白，形成活化整合素蛋白复合体。我们利用基因编辑技术，构建Kindlin-2 K383A/K385A基因突变小鼠，破坏Kindlin-2 PH结构域，探索其对心脏发育、整合素激活及整合素上下游通路的影响。结果表明，全基因Kindlin-2 K383A/K385A基因突变小鼠会出现小鼠在胚胎中期出现心肌致密化不全、室间隔缺损、主动脉骑跨等心脏发育异常，小鼠在胚胎期全部死亡。心肌细胞增殖率明显降低，凋亡率增加，心肌细胞的粘附、伸展能力下降。进一步研究发现，Kindlin-2 K383A/K385A基因突变小鼠心肌细胞中整合素的量和位置没有改变，但是活化的整合素水平明显降低。由于胚胎时期心脏主要由心肌细胞和内皮细胞构成，为了明确心脏表型是否是由于心肌细胞的异常引起，我们构建了心肌细胞特异性Kindlin-2 K383A/K385A基因突变小鼠，仅有心肌细胞表达突变的Kindlin-2，结果显示，小鼠在胚胎期并未出现心脏结构和功能的异常。我们又构建了内皮细胞特异性Kindlin-2 K383A/K385A基因突变小鼠，结果显示小鼠胚胎期心脏也无明显结构和功能的异常，小鼠的生存曲线与对照组无明显差异。这些结果提示，Kindlin-2 K383A/K385A基因突变能够影响整合素活性，造成心脏发育异常，但是这种作用可能是心肌细胞和内皮细胞共同作用的结果。本课题的研究，有助于阐明Kindlin-2在心脏发育中作用及其激活整合素的分子机制，提出激活整合素的新靶点，为先天性心肌病及其他整合素相关性疾病的临床诊断和治疗提供新的思路。