胃癌及NF-κB对网膜乳斑巨噬细胞表型转化的研究

网膜乳斑中含有大量巨噬细胞，能够捕获肿瘤细胞但不能彻底杀灭，成为胃癌腹膜转移的早期位点。巨噬细胞分为M1型和M2型，M1型巨噬细胞具有杀伤肿瘤细胞的作用，而M2型却促进肿瘤生长。网膜乳斑具有杀伤肿瘤和支持其生长的双重作用。研究表明，NF-κB能维持M2型巨噬细胞的免疫抑制性，促进肿瘤生长。IκB激酶β在NF-κB活化过程中起决定作用。本研究拟通过流式细胞术检测膜表面F4/80和CD16/32，间接免疫荧光染色法检测CD206、MGL和DECTIN-1的表达，ELISA检测细胞因子IL-12和IL-10的分泌，RT-PCR和酶活性定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性，鉴定胃癌不同分期网膜乳斑巨噬细胞分型，为胃癌根治术保留处于M1型巨噬细胞大网膜，提供理论依据。通过表达负显性IKKβ抑制剂重组腺病毒感染M2型巨噬细胞，研究M2型向M1型转化的方法，探索利用网膜乳斑巨噬细胞治疗胃癌的新途径。

目的:鉴定胃癌不同分期网膜乳斑巨噬细胞表型，沉默人IKKβ基因RNA干扰腺病毒感染胃癌不同分期网膜乳斑巨噬细胞，探索治疗胃癌的新途径。方法:1.收集不同分期胃癌患者大网膜乳斑标本50例以及正常人大网膜乳斑标本10例。分离纯化培养巨噬细胞，免疫荧光染色以及流式细胞术(FCM)检测鉴定巨噬细胞表型情况、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测不同时间点巨噬细胞IL-10、IL-12的分泌情况。对网膜乳斑巨噬细胞表型与胃癌病理学特征进行相关性分析。2.通过transwell共培养系统将巨噬细胞、单核细胞和胃癌细胞SGC-7901共培养，hoechst染色试剂盒检测胃癌细胞的凋亡情况，胎盘蓝染色细胞计数法检测胃癌细胞的侵袭力。3.设计合成4对IKKβ基因的特异性小干扰RNA(siRNA)，利用重组质粒成功构建重组腺病毒，感染不同分期胃癌患者大网膜巨噬细胞，SABC免疫组化鉴定巨噬细胞表型转化，PCR检测巨噬细胞中IKKβ基因mRNA变化，蛋白免疫印迹检测巨噬细胞中NF-κB P65蛋白表达的变化.结果:1.流式细胞术检测对照组及T1-3期组CD68+/CD206- Mφ数量明显高于T4期组为主。T4期组CD206+ M2数量明显高于对照组及T1-3期组。ELISA检测对照组、T1-3期组大网膜乳斑巨噬细胞不同时间点IL-10的平均分泌量均低于T4期组，而IL-12平均分泌量均高于T4期组。CD68+/CD206- Mφ、CD206+ M2的表达与肿瘤是否侵犯浆膜、淋巴结转移及临床分期有关，而与肿瘤大小及分化程度无关。2.T4期组胃癌细胞生长较快，明显高于空白对照组和T1-3期组；而穿膜细胞数明显多于空白对照组和T1-3期组。T1-3期组胃癌细胞凋亡，明显高于空白对照组和T4组。3.所获siRNA腺病毒测序正确，并成功感染T1-3期胃癌患者、T4期胃癌患者巨噬细胞，使T4期胃癌患者向T1-3期胃癌患者巨噬细胞转化，T4期胃癌患者巨噬细胞中IKKβ基因转录及NF-κB P65表达均降低。结论:1.T1-3期胃癌患者大网膜乳斑巨噬细胞以M1型为主，T4期胃癌患者大网膜乳斑巨噬细胞以M2型为主2.T1-3期胃癌患者巨噬细胞促进胃癌细胞凋亡,T4期胃癌患者巨噬细胞促进胃癌细胞生长和侵袭。3.沉默人IKKβ基因腺病毒使巨噬细胞表型发生转化，IKKβ基因转录及NF-κB P65表达下调。