CIK细胞为载体TNF-α溶瘤腺病毒靶向自分泌式杀伤胃癌的实验研究

The comprehensive treatment at present is not satisfactory evern if discovering recurrence and metastasis Lesions of gastric cancer. Exogenous TNF-ɑ is eliminated easily by the body in the process of killing gastric cancer .and can not reach a perfact outcome. This project uses automatic bead extraction and purification system to isolate CIK cells from normal human peripheral blood, transform the oncolytic virus to carry TNF-ɑ gene through the technology of molecular genetic engineering. Establish animal models of gastric cancer bearing nude mice. CIK cells as the carrier carry recombinant oncolytic adenovirus which bring the TNF-ɑ can be targeted to reach the gastric cancer tissues based on the cells targeting to gastric cancer.CIK cells which kill gastric cancer cells by direct and indirect immune response can release TNF-ɑ oncolytic adenovirus after their own apoptosis, TNF-ɑ oncolytic adenovirus effect gastric cancer cells by proliferation,autocrine and releasing TNF-ɑ after adenovirus infect tumor cells.This experiment is designed to study survival curves and survival rate of gastric cancer nude mice model,the expression of TNF-ɑ and casepage-3, 8 and clinicopathological necrosis features of gastric cancer tissue. Autocrine of TNF-α Oncolytic adenovirus joint CIK cells to kill gastric cancer in this project is expected to become the new method of clinical application of anti-metastasis and recurrence of gastric cancer.

胃癌复发转移后现行的综合治疗方法效果差。外源性TNF-ɑ应用杀伤胃癌易被机体清除的影响，达不到良好的治疗效果。本项目利用全自动磁珠提取纯化系统从正常人体外周血中分离CIK细胞；通过分子基因工程改造溶瘤腺病毒携带TNF-ɑ基因；并建立胃癌裸鼠模型。基于CIK可靶向到达胃癌组织，以CIK细胞为载体携带TNF-α溶瘤腺病毒靶向到达胃癌组织，通过CIK细胞免疫杀伤胃癌，裂解后释放出TNF-α溶瘤腺病毒，该病毒近距离感染胃癌细胞，通过自身增殖杀伤胃癌细胞同时，使感染的胃癌细胞自分泌释放TNF-ɑ近距离内分泌式杀伤胃癌，起到三重生物杀伤胃癌细胞的作用。通过研究胃癌裸鼠生存曲线以及生存率，胃癌组织中TNF-ɑ表达以及casepage-3,8的表达和胃癌组织坏死的临床病理特点确定治疗效果。本项目的目标是解决晚期胃癌治疗效果差的难题，有望成为临床应用杀伤转移复发胃癌治疗的新方法，提高晚晚期胃癌的治疗效果。

胃癌的生物免疫治疗成为研究热点。研究表明单核巨噬细胞分泌的TNF-α有杀伤胃癌的作用，但机体在发生肿瘤以及应急状态自身分泌的TNF-α杀死胃癌的作用较弱。应用外源性TNF-α经脉注射要达到治疗量，机体难以耐受药物本身副作用。本课题设计构建携带人TNF-α基因的双靶向溶瘤腺病毒（AD-TNF-α-EGFP），研究其联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对胃癌的杀伤作用。PCR法从含有TNF-α质粒中获得人TNF-α基因，将该基因插入到溶瘤腺病毒基因组中，构建携带人TNF-α基因的双靶向溶瘤腺病毒（AD-TNF-α-EGFP）以及空载病毒（AD-EGFP）。MTT法检测病毒对胃癌细胞的杀伤作用，ELISA法检测TNF-α的表达情况。外周血中分离CIK细胞，病毒分别感染人胃癌细胞（SGC-7901）、成纤维细胞（BJ）及CIK细胞，荧光显微镜观察效果及病毒复制增殖能力；细胞病理效应（CPE）实验观察病毒对三种细胞的杀伤能力。CIK细胞感染病毒后将其分为实验组TNF-α溶瘤腺病毒联合CIK细胞（AD-TNF-α-EGFP-CIK）、对照组空载体溶瘤腺病毒联合CIK细胞（AD-EGFP-CIK）及单独使用CIK组，MTT法检测三组CIK细胞杀伤能力，ELISA法检测三组CIK细胞TNF-α的表达量。建立胃癌裸鼠模型，研究三组CIK细胞对胃癌移植瘤变化、胃癌组织中TNF-ɑ表达以及胃癌组织坏死的临床病理特点。 限制性内切酶鉴定及PCR鉴定，携带TNF-α基因的双靶向溶瘤腺病毒以及空载组病毒构建成功。AD-TNF-α-EGFP在MOI =1时即可对胃癌细胞明显抑制。CPE实验显示AD-TNF-α-EGFP对胃癌细胞的杀伤力强于AD-EGFP。MTT显示三组实验杀伤作用取决于效靶比和作用时间的不同，当效靶比相同时24h后，对SGC-7901的杀伤力：AD-TNF-α-EGFP-CIK细胞>AD–EGFP-CIK细胞>CIK细胞（P<0.01）。ELISA检测三组TNF-α的表达量，实验组与空载体对照组、CIK细胞组比较均有显著统计学差异(P<0.01)；空载体对照组与CIK细胞组之间比较无统计学差异(P>0.05)。裸鼠胃癌模型建立成功，AD-TNF-α-EGFP-CIK细胞组的TNF-ɑ高表达，对肿瘤生长抑制最明显，杀伤作用最强。生物免疫，基因-病毒靶向治疗是治疗胃癌的有效方法。