Ring1通过调节p53蛋白表达影响肿瘤细胞凋亡和衰老等的作用机制研究

Polycomb group (PcG) proteins are transcriptional repressors that epigenetically modify chromatin and participate in the maintenance of cell fates including tumorigenesis. Two main families of PcG complexes, named polycomb repressive complexes 1 and 2 (PRC1 and PRC2), are reported. Ring1, along with RNF2 and Bmi1, is a member of PRC1 core components, and functions as E3 ubiquitin ligase that is responsible for histone H2A modification and transcriptional repression. So far, little is known about the exact role and molecular mechanisms of Ring1 in tumorigenesis. Our preliminary data have suggested that Ring1 may affect the biological functions of tumor cells, including apoptosis and senescence, through the regulation of p53 protein expression. Herein,we aim to investigate the effects and underlying mechanisms of Ring1 on apoptosis and senescence in human liver and colon cancer cells, and whether this effect is dependent on p53 status. We also aim to explore the molecular mechanisms of Ring1 in regulating p53 protein expression. Taken together, we speculate that p53 may be a potential target of Ring1 and thus mediate the biological functions of Ring1 during tumorigenesis. This study will help to elucidate the role of PRC1 in tumors and provide a novel molecular target for cancer treatment.

哺乳动物PcG蛋白家族以多梳抑制复合物(PRC）形式发挥转录抑制作用，与肿瘤发生发展密切相关。Ring1为环指家族成员，与RNF2等环指蛋白组成PRC1复合物的核心，参与维持该复合物稳定性并具有E3泛素连接酶活性。目前有关Ring1与肿瘤的关系缺乏系统深入的研究。我们前期工作发现，Ring1可能通过调节p53蛋白水平和功能而影响肿瘤细胞凋亡和衰老。本项目拟综合应用多种生物技术，以消化道肿瘤细胞为主要研究对象，通过改变Ring1蛋白表达水平，研究Ring1影响肿瘤细胞凋亡、衰老等的作用机制及其与p53的关系；并拟从p53泛素化降解等方面深入阐释Ring1调节p53蛋白表达的分子机制。本项目属首次提出p53可能是受Ring1调节的靶蛋白，有助于全面理解PRC1复合物在肿瘤中的作用特点，有望为抗肿瘤治疗提供新的分子靶点。

RING1 蛋白是PcG家族成员之一，在胚胎发育及维持干细胞的全能性上发挥重要作用，其在在肿瘤中的功能研究并不清楚。我们选择了人肝癌细胞HepG2及人结肠癌细胞HCT116为研究对象，针对性地研究了RING1在两种肿瘤发生发展中的作用。敲低细胞中的RING1发现，细胞内p53蛋白水平升高，但mRNA水平变化不明显，提示RING1可能从蛋白水平调节p53表达。在RING1敲低的细胞中p53半衰期显著延长，稳定性增加；而过表达RING1后p53的蛋白半衰期缩短，提示RING1负调节p53蛋白的稳定性。利用免疫荧光实验证实，内源的RING1与p53共定位于细胞核内。通过免疫共沉淀及pull-down 实验证实RING1蛋白与p53蛋白之间直接结合。鉴于RING1具有E3泛素连接酶活性，我们发现过表达RING1能够促进p53蛋白发生泛素化降解，敲低RING1后抑制p53的泛素化降解。体外泛素化实验证实RING1能够独立地不依赖于PcG家族其他成员调控p53泛素化降解过程，且环指结构域在RING1对p53的调控中发挥着重要作用。RING1对p53的降解作用均不依赖于RNF2的存在。通过生长曲线及克隆形成实验，我们证实 RING1 敲低能够肿瘤细胞增殖，诱导G1期阻滞，细胞凋亡数目增加，敲低RING1的同时联合使用依托泊苷，能够增加依托泊苷诱导细胞凋亡的能力，并诱导细胞衰老。在p53缺失的HCT116细胞中，RING1敲低后对肿瘤细胞增殖的抑制作用明显减弱，提示RING1敲低后的抗增殖效应依赖于p53的功能。迁移实验发现， RING1敲低能够抑制肿瘤细胞迁移。裸鼠体内移植瘤实验发现RING1敲低能够显著抑制该肿瘤细胞的成瘤能力。此外，RING1表达与肝癌的发生发展正相关，肝癌组织中RING1表达水平显著高于癌旁组织。综上所述，我们的研究发现p53是RING1的多聚泛素化底物。RING1能够在不依赖于PcG蛋白其他家族成员的条件下与p53结合，促进p53发生泛素化降解，进而影响肿瘤细胞的增殖、周期分布、衰老、凋亡及迁移等过程。此外我们发现， RING1蛋白水平与肝癌的发生发展密切相关，提示RING1可能有望成为肝癌诊断及治疗的新的生物靶分子。