乙肝病毒基因经人精子传递新途径研究：甲基化对HBV基因在胚胎细胞中复制和表达的影响

正常人精子经含有乙肝病毒和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pIRES2-EGFP-HBV转染，然后与金黄地鼠去透明带卵受精。分别制备转染后的人精子、受精卵和二细胞胚胎样本，用甲基化特异性PCR和亚硫酸氢钠测序法检测上述样本中HBV基因启动子区的甲基化状态；同时用FISH检测HBV基因在精子核和受精卵雄原核中的整合及二细胞胚中的复制，用RT-PCR和Western blot检测HBV基因在上述样本中的转录和翻译；分析其与HBV基因启动子区甲基化状态的关系。再分别对甲基化的HBV基因启动子区进行去甲基化处理，对呈去甲基化的HBV基因启动子区进行甲基化处理，分析HBV基因启动子区甲基化状态的变化是否导致HBV基因复制和表达的变化。若获预期结果，将有可能从表观遗传学角度阐明精子介导的HBV基因在胚胎细胞中复制和表达的分子机制。

目的：探索乙肝病毒基因经人精子传递至胚胎过程中表达调控的分子机制。方法与结果：含HBV全序列的质粒pBR322-HBV经甲基化修饰；人精子用甲基化和非甲基化两种质粒分别转染后与金黄地鼠去透明带卵受精，获得受精卵与2-细胞胚胎。1. MSP和BSP检测结果：①当用未甲基化质粒转染人精子时，HBs和HBx基因启动子区均呈低甲基化状态；在质粒、精子和2-细胞胚胎中HBs CpG位点的甲基化率依次为0.89%、1.78%和0.89%；HBx则依次为2.04%、3.06%和2.04%，相互间差异没有统计学意义（P>0.05）；表明在人精子中没有使HBs和HBx启动子区“从头甲基化”的机制。②当用甲基化质粒转染精子时，在质粒、精子和2-细胞胚胎中，HBs CpG位点的甲基化率依次为95.50%、81.42%和1.78%；HBx则依次为96.93%、95.00%和3.06%；HBs启动子区甲基化率在质粒与精子间差异非常显著（P<0.001），而HBx启动子区甲基化率在二者之间则非常相近（P>0.05），表明精子中可能存在一种特异于HBs基因启动子区去甲基化的机制。2. RT-PCR和real time qRT-PCR检测结果：①未甲基化质粒转染精子中的HBs转录水平是甲基化质粒转染精子中的11.6倍；而与之相对应，前者启动子区甲基化率（1.78%）比后者（82.14%）低得多；表明在精子中HBs基因的转录水平随着其启动子区甲基化程度增高而降低。②HBx基因在甲基化质粒转染的精子中几乎没有转录，与之相对应，其启动子区呈高度甲基化状态（95%）。③无论是HBs还是HBx，其启动子区在2-细胞胚胎中都发生了去甲基化，并具有转录功能。3. 免疫荧光检测结果：在2-细胞胚胎中观察到HBs基因的翻译，但在精子中未观察到。结论：在HBV 基因从精子垂直传递至胚胎的过程中，甲基化对基因的表达调控发挥了重要作用。