乙肝病毒基因经人精子传递新途径研究：胚胎细胞相关基因的筛选、鉴定与功能分析

正常人精子经含有乙肝病毒和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pIRES2-EGFP-HBV转染为实验组、未经转染者为对照组。分别与金黄地鼠去透明带卵受精。收集显绿色荧光(实验组)和未显绿色荧光(对照组)的2-细胞胚，提取RNA作Smart扩增。所得cDNA互为Tester和Driver，联合应用正、反向抑制消减杂交和芯片技术进行差异表达基因的筛选和鉴定；确定在早期胚胎细胞中哪些宿主基因参与了HBV基因的复制和表达事件；应用生物信息学分析、FISH和RT-PCR鉴定宿主靶基因的功能；应用RNAi、FISH，RT-PCR、Western、ELISA和免疫荧光检测技术探讨这些基因的功能受到干扰时对HBV基因复制与表达的影响。若获预期结果，不仅在病毒传播的分子机制研究中具有重要理论意义，还在阻断HBV传播、提高生育素质和防止肝癌发生方面具有广阔应用前景。

近年来，乙肝病毒（HBV）通过生殖细胞垂直传递至胚胎这一新途径是目前该领域的研究热点。但乙肝病毒具有嗜肝性，HBV基因为什么能在非肝细胞的精子和胚胎细胞中表达成为学者们关注的重要课题。. 本研究用正常人精子经含有HBV和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pIRES2-EGFP-HBV转染为实验组、未经转染者为对照组，分别与金黄地鼠去透明带卵母细胞受精。收集显绿色荧光(实验组)和未显绿色荧光(对照组)的2-细胞胚胎，提取总RNA进行Smart扩增；所得cDNA互为Tester和Driver进行正、反向抑制消减杂交；将杂交产物进行T/A克隆，购建重组质粒pGEM-T-X，用其转化E. coli DH5α，经过蓝白斑筛选，构建正反消减文库；再用芯片检测、测序等技术进行差异表达基因的筛选和鉴定；应用生物信息学分析，确定在早期胚胎细胞中哪些宿主基因参与了HBV基因的表达调控；选择差异表达水平最高的5个宿主基因作为靶标基因，应用RT-PCR证实了它们在胚胎细胞中的存在和表达。针对5个靶标基因，合成干扰其表达的siRNA序列。将含有siRNA序列的质粒和含有HBV序列的质粒共同转染精子，并用其与金黄地鼠去透明带卵母细胞受精，分别用转染精样和其受精所得的2-细胞胚胎作为实验组，只用含有HBV序列转染的精样和其受精所得的2-细胞胚胎样本为对照组，应用real time qRT-PCR技术探讨5个靶标基因的表达受到干扰时，对HBV基因表达水平的影响。结果表明5个靶标基因均参与了HBV S和X基因的表达调控。所得结果不仅在病毒传播的分子机制研究中具有重要理论意义，还在阻断HBV传播、提高生育素质和防止肝癌发生方面具有广阔应用前景。