基于同位素轮廓指纹比对和同重二甲基标记的整体蛋白质组定量研究

Saccharomyces cerevisiae is the most related yeast to the humankind; it is not only widely used in the food processing, but also one of the most widely studied model organisms in molecular and cellular biology. Since genome sequencing of Saccharomyces cerevisiae in 1996, enzyme-based bottom-up proteomics has been devoted to qualitatively and quantitatively characterize its proteome. On one hand, it is to verify expression of individual genes and elucidate gene function at the protein level; on the other hand, it is to push and test the development of related technologies and methods. With nearly 20 years’ efforts, bottom-up proteomics currently has been able to efficiently characterize the whole proteome of Saccharomyces cerevisiae to provide amino acid sequence and post-translational modification information of peptides; simultaneously species-generic bottom-up proteomics technologies and methods have been successfully developed using this model organism. On this basis, protein function study also needs complete molecular information (combinatorial post-translational modifications, polymorphisms and proteolysis) of proteins. This combinatorial molecular information could be provided by the newly developing top-down proteomics. Based on intact proteome two-dimensional liquid chromatography separation and database search engine developed previously in the applicant’s group, this proposal is to research intact proteome quantitation using isobaric dimethyl labeling, isotopic envelope fingerprinting database search and Saccharomyces cerevisiae as model organism.

酿酒酵母是与人类关系最密切的一种酵母；它不仅被广泛应用于食品加工，同时也是分子和细胞生物学研究中最广泛使用的模式生物。自1996年酿酒酵母的全基因序列被测定以来，基于酶切策略的自下而上蛋白质组学便致力于该物种蛋白质组的定性定量表征；一方面验证各个基因是否表达和在蛋白水平上阐明各个基因的功能，另一方面推动和检验相关技术和方法发展。经过将近20年的努力，自下而上蛋白质组学目前已经能够高效地对酿酒酵母的蛋白质组进行全鉴定；同时成功了发展了各物种普适的自下而上蛋白质组鉴定的技术和方法。在此基础上，蛋白质功能研究尚需部分蛋白质分子上组合式的翻译后修饰、氨基酸突变以及水解等完整分子信息。这部分信息可以由新近发展起来的自上而下蛋白质组学来提供。本项目拟以酿酒酵母为模式生物，申请人前期发展的整体蛋白质组二维液相色谱分离和数据库搜索引擎为基础，研究基于同重二甲基标记和同位素轮廓指纹比对数据库搜索的整体蛋白质

蛋白质的结构和功能与其特定的氨基酸序列、翻译后修饰及其位点和结构一一对应。本项目面向完整蛋白质组的定量，开展了四方面的研究：1) 探究了中性丢失及内部碎片离子对蛋白质鉴定的影响；2) 探究了蛋白质同重二甲基标记，并在细胞模型 (HepG2相对于LO2) 水平上开展了肝癌差异表达蛋白质的研究；3) 针对磷酸化分析灵敏度度低及在中性丢失情况下定位不准的问题，开展了新型富集材料及定位工具的研发；4) 针对糖基化结构组学鉴定方法仍然缺失的问题，开展了完整N-糖蛋白选择性解离、N-连接糖数据库搜索引擎开发、基于细胞模型（MCF-7相对于MCF-10A）的完整N-糖肽水平上的乳腺癌差异表达N-糖基化的鉴定。获得了如下重要结果和关键数据：1) 发现了中性丢失及内部碎片离子对蛋白质的鉴定没有直接的贡献，但它们参与重叠数据的解析可以使得更多的正则碎片离子得以释放，从而大大提高蛋白质鉴定的可信度以及翻译后修饰被准确定位的可能性；将相关研究结果整合到整体蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle中开发出了2.0版本，该版本在HeLa核心组蛋白的鉴定中表现出了比现有主流商业化ProSightPC 2.0更高的准确度和效率；在模式动物鸡血核心组蛋白的应用分析中，共鉴定到了58个含有组合翻译后修饰的蛋白异构体；2) 成功地将同重二甲基标记定量方法引入到了整体蛋白质的定量，将线性动态范围从文献报道的10倍提高到50倍；在肝癌细胞HepG2的应用分析中，共鉴定到33个差异表达蛋白质变体；3) 基于包含磷酸化基团的位点决定性碎片离子，发展了磷酸化修饰定位工具P-bracket，在标准磷酸化多肽中表现出了比现有主流商业化产品phosphoRS更高的效率和准确度，并开展了HeLa细胞磷酸化修饰定位的应用分析；合成了Ti(IV)-ATP-NPs和Ti(IV)-ATP-PEI-MPs等新型磷酸化蛋白富集材料；4) 实现了RNase B N-连接糖部分的选择性解离；开发了N-连接糖结构特异性搜索引擎GlySeeker；在乳腺癌细胞中共鉴定到581个完整N-糖肽，其中56个在MCF-7中有差异表达。本项目为基于质谱的蛋白质翻译后修饰组合、定位和结构鉴定及定量提供了更准确更高效的方法和工具。