温州蜜柑与HB柚二倍体胞质杂种雄性不育的功能基因研究

果实无核对提高鲜食柑橘的食用品质和商品价值具有重要意义。申请人针对我国特色柑橘种籽多的问题，提出了二倍体无核育种的新思路，创造了一批转温州蜜柑胞质雄性不育性的2X胞质杂种等细胞工程新种质；其中，国庆1号温州蜜柑与HB柚的胞质杂种已开花且表现雄性不育。本项目旨在利用这一人工创造的类似突变体的HB柚胞质杂种（仅线粒体基因组与原叶肉原生质体亲本HB柚不同），从转录组、蛋白组层面，发掘新型核质互作背景导致其雄性不育的功能基因。通过构建其花器官SSH-cDNA文库，给合基因芯片寻找与雄性不育相关的候选基因；通过其花器官的蛋白组学分析并结合质谱鉴定，寻找与转录组分析吻合或互补的差异蛋白；在此基础上，初步解析2-3个功能基因在雄性不育性状形成中的作用。本项目是申请人多年研究的深入和延续，试材独特，将发掘一批柑橘雄性不育的功能基因、进而促进柑橘果实无核的分子设计育种，具有重要的理论和实践意义。

本项目以HB柚及通过体细胞融合获得的胞质杂种—华柚2号（其核基因组来自HB柚，线粒体基因组来自国庆1号温州蜜柑）为研究对象。细胞学观察表明，“华柚2号”花器官形态异常可能原因如下：一是早期雄蕊原基的发育受到明显抑制，导致雄蕊数量明显减少且发育受到影响；二是雄蕊形态异常，花药不能形成正常的四个药室且绒毡层及花粉壁发育异常。为揭示华柚2号雄性不育机理，通过RNA-Seq分离花芽发育早期 “华柚2号”与HB柚的差异表达基因；结果表明，花芽分化调控基因、线粒体内膜电子链相关基因、激素代谢相关基因在“华柚2号”中表达量显著下降，表明“华柚2号”激素代谢出现异常，可能导致花器官发育异常；MYB、NAC转录因子（均与抗逆境胁迫相关）在“华柚2号”中表达量显著上升，推测由于胞质杂种拥有外来线粒体基因组，增强了相应的胁迫应答机制有关。采用iTRAQ技术分离“华柚2号”及HB柚花芽发育全过程的差异蛋白点；功能分类表明，差异蛋白质主要参与线粒体代谢、糖类及能量代谢以及脂类、蛋白质合成等过程；Western Blot验证表明CYP716B在“华柚2号”花芽发育晚期明显下调表达；该基因定位于细胞核。蛋白质组与转录组关联分析表明，“华柚2号”、HB柚中mRNA与蛋白质关联系数均较低，推测可能HB柚中存在大量转录后调控以保障HB柚花器官的正常发育及其育性，而“华柚2号”外来的线粒体基因组通过与核基因组间的反馈调节作用调控其核基因的表达，扰乱转录后调控，导致其雄性不育。基于转录后调节机制对“华柚2号”雄性不育特性的重要调控作用，检测“华柚2号”与HB柚的miRNA表达，共鉴定73个保守和15个非保守known miRNA以及23个柑橘中特有novel miRNA；通过降解组测序鉴定出24个known miRNAs和2个novel miRNA的62个靶基因，基因注释分析表明多数靶基因为具有重要作用的转录因子。本项目培养研究生5人，其中毕业2人；发表SCI论文4篇，申报国家发明专利1项。