扶阳固脱法调控高迁移率族蛋白B1启动子的研究

中医扶阳学说的核心思想是扶阳药需早用、重用，扶阳即可祛邪。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是内毒素休克晚期致死性的关键毒性因子，受内毒素刺激后分泌出胞。参附液扶阳固脱，是治疗内毒素休克的临床常用药，前期研究发现能减少HMGB1表达，推测参附液可能参与沉默子结合而减少HMGB1表达，从而抑制炎症因子表达。本项目通过克隆HMGB1增强子和沉默子，构建荧光素酶启动子报告基因，研究参附液调控HMGB1启动子作用；构建TNFα /iNOS报告基因，用siRNA技术研究参附液调控HMGB1抑制炎症因子转录；在体实验用EMSA/Western blot、ELISPOT等技术研究参附液对HMGB1启动子结合蛋白和表达的影响；全面探讨参附液调控HMGB1启动子机制。本项目是在前期"开闭固脱"治疗内毒素休克研究基础下的深入研究，可阐述中医扶阳理论的分子机制，并揭示感染性疾病中医"同病异治"理论的规律性。

HMGB1是内毒素休克晚期致死性的关键性因子，受内毒素刺激后分泌出胞。参附液扶阳固脱，是治疗内毒素休克的临床常用药，前期研究推测参附液可能参与沉默子结合而减少HMGB1表达，抑制炎症因子表达。本项目基本完成了计划内容，研究成果简述如下：.1. 本项目观察参附注射液对大鼠内毒素休克后的治疗作用及心肌细胞炎症因子HMGB1、PPAR-y、NF-Kβ表达的影响。发现参附注射液能改善内毒素休克大鼠的血压与存活率。其机制可能与抑制炎症因子HMGB1、PPAR-γ、NF-KBp65、HDAC3、P300、CD36、LXRβ、ABCA1的表达有关。现正在数据整理阶段，初步结果表明参附注射剂可明显抑制HMGB1，与以往实验不同之在于其证明了正性药物也能抑制细胞毒性因子的表达，从证明了中医的扶正祛邪机理。拟发表SCI论文1-2篇。.2. 本项目验通过LPS诱导小鼠单核-巨噬细胞株RAW264.7建立促细胞分泌HMGB1模型，研究参附注射液对LPS诱导的巨噬细胞HMGB1表达的影响，探索中医扶阳学说扶正祛邪的理论依据。结果发现参附注射液可以促进HMGB1核移位以及减少HMGB1在胞质的表达量，增加HMGB1在细胞核内的表达量，使HMGB1在核内高表达。参附注射液可降低LPS诱导的RAW264.7细胞培养上清中分泌HMGB1的含量，抑制HMGB1分泌出胞。本工作在研究生黄开远同学硕士毕业文中展现。.3. 本项目观察了次乌头碱对LPS休克大鼠急性肺损伤的治疗作用及其对PPAR-γ信号转导通路的调控作用。发现次乌头碱可能通过刺激PPAR-γ生成而抑制炎性因子，与以往其它治疗急性肺损伤的不同之处在于它是通过正性治疗而不是强行抑制的方法，中医角度讲即是“扶阳抑阴”。目前相关检测工作已完成，目前在数据整理及论文书写进程中。拟发表SCI论文1-2篇。.4. 已构建HMGB1启动子双荧光素酶报告基因，采用电转染等方法瞬时转染293T细胞RAW264.7细胞，检测参附注射液有效成分对HMGB1启动子影响。已构建Tet-On过表达HMGB1和突变型HMGB1慢病毒，稳定转染RAW264.7细胞，四环素法筛选稳定过表达HMGB1和突变型HMGB1的RAW264.7细胞株，建立药物筛选技术。已发表国内核心期刊论文1篇。.5. 本实验主要以HMGB1为研究对象，观察附子成分次乌头碱对损伤后内皮细胞的保护作用，并