牛珀至宝微丸调控高迁移率族蛋白B1解毒祛邪的分子机制

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是内毒素休克晚期致死性的关键炎症因子，受内毒素刺激后分泌出胞。牛珀至宝微丸是治疗内毒素休克的经典名方，前期研究发现能上调HMGB1但只在核内高表达的独特现象，推测牛珀至宝微丸可能通过组蛋白乙酰基转移酶/去乙酰基酶（HATs/HDACs）乙酰化修饰HMGB1，使其定位于细胞核内，通过与核转录因子（NF-κB）的结合抑制炎症因子转录，发挥解毒祛邪功效。因此，通过在体动物和体外细胞实验用免疫共沉淀法结合MADLI-TOF/MS技术分析HMGB1核定位簇乙酰化位点，用染色质免疫共沉淀技术观察HMGB1与DNA和NF-κB的结合情况，用HMGB1 siRNA结合荧光素酶启动子报告基因技术观察炎症因子转录，探讨牛珀至宝微丸对HMGB1乙酰化修饰和抑制炎症因子转录作用。本项目是在中医临床经验和基础理论指导下对经典名方解毒祛邪功效的分子机理研究，对于中医急症研究有重要意义。

本项目按计划完成体外细胞实验与报告基因实验的主要内容，已取得的研究成果简述如下：.1、本项目通过大量实验提取和验证了牛珀至宝微丸有效成分，为进一步研究打下基础。为明确牛珀至宝微丸有效成分，项目组根据传统制剂方法，采用渗滤提取和回流提取两种方法，获得牛珀至宝微丸及减方后的乙醇提取液，通过高效液相确定提取物质量标准，再以细胞模型采用报告基因、荧光定量PCR、MTT、免疫荧光、Western blot等实验方法确定其有效成分的物质基础，已经发现丹皮、大黄、石菖蒲、西红花等为其主要药效来源，丹皮酚、大黄素、β-细辛醚和西红花苷-I等为其主要药效成分。.2、重点研究了丹皮酚、大黄素和β-细辛醚对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）药效作用的调控机制，发现三者可能存在协同作用，拟进一步深入研究其核内共阻遏调控机制。研究结果表明，丹皮酚通过调控HDAC3/P300核内乙酰化平衡来影响HMGB1的核转位，而且可能因此而调控了过氧化物增殖酶体激活物受体γ（PPARγ）等核受体通过核内共阻遏机制抑制炎症因子表达；大黄酚可能是大黄抗炎的主要活性成分，大黄中抗炎成分的筛选是另外一个很有意义的研究课题；β-细辛醚减少细胞质中HMGB1而增加细胞核中HMGB1表达，抑制NF-κB启动子活性。.3、构建了TNFα/NF-κB/ HMGB1启动子双荧光素酶报告基因，建立了药物作用的筛选方法。Tet-On过表达HMGB1和突变型HMGB1慢病毒，稳定转染RAW264.7细胞，四环素法筛选稳定过表达HMGB1和突变型HMGB1的RAW264.7细胞株，建立药物筛选技术。.4、利用SuperArray第二代功能分类基因芯片技术和ChIP-on-chip技术研究牛珀至宝微丸有效成分调控转录因子及核染色质修饰酶表达的影响和牛珀至宝微丸有效成分对HMGB1与DNA结合的影响。研究结果表明丹皮酚是牛珀至宝微丸的重要药效成分，牛珀至宝微丸和参附注射液都可以调控乙酰化修饰酶，还可以调控泛素化酶、甲基化酶。通过比较基因调控网络，发现牛珀至宝微丸（解毒开窍法）和参附注射液（扶阳固脱法）都可能通过核内共阻遏机制和染色质结构和染色质结构修饰共同作用于炎症因子转录的起始阶段，从不同的关键调节因子、关键机制调控共同的炎症反应通路，可能是中医“同病异治”治疗内毒素休克的科学依据。