纯化骨髓源性肝干细胞和内皮祖细胞联合移植对肝纤维化的双重逆转作用

肝纤维化在肝细胞减少的同时存在细胞外基质的过度沉积。后者所致的肝组织结构破坏、肝窦状隙缩窄以及肝小血管闭塞，给干细胞移植治疗肝纤维化带来巨大障碍。设想将促血管重建的内皮祖细胞（EPC）和促肝细胞再生的肝干细胞（BDLSC）联合移植，利用这两种不同功能，相辅相成，全面治疗肝纤维化。胆总管结扎诱发大鼠淤胆型肝损伤，提取骨髓单核细胞，免疫磁珠分选纯化β2m-/Thy-1+BDLSC，同法获得正常大鼠骨髓中CD133+EPC，二者共培养观察相互作用。分别建立三种致病因素诱导的大鼠肝纤维化模型，在造模不同时间点将BDLSC和EPC移植入体内，检测BDLSC和EPC在肝脏的种植、分布和融合情况，评估血管新生化、肝细胞再生、肝纤维化、肝功能和凝血功能等改善情况，籍以评价BDLSC和EPC联合移植对肝纤维化的双重逆转作用。本研究将为肝纤维化治疗的全面性、有效性和安全性提供理论依据和实践基础，指导临床应用。

肝纤维化在肝细胞减少的同时存在细胞外基质的过度沉积。后者所致的肝组织结构破坏、肝窦状隙缩窄以及肝小血管闭塞，给干细胞移植治疗肝纤维化带来巨大障碍。为解决这一问题，本项目组将促血管重建的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）和促肝细胞再生的肝干细胞（liver stem cells, LSCs）联合移植，利用这两种不同功能，相辅相成，全面治疗肝纤维化。我们应用四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）皮下注射6周建立大鼠肝纤维化模型，通过密度梯度离心法从其骨髓中分离单个核细胞，一方面利用免疫磁珠分选法分选纯化β2m-/Thy-1+ 骨髓源性肝干细胞（bone marrow-derived liver stem cells, BDLSCs），另一方面利用差速贴壁培养法诱导培养EPCs，并对这两种细胞进行鉴定。应用DAPI核染色BDLSCs、PKH26荧光标记EPCs，将其分别经门静脉分支和尾静脉移植入肝纤维化大鼠体内，观察这两种细胞在肝内迁移和种植情况。最后将BDLSCs和EPCs联合移植入大鼠体内，观察肝脏血管新生化、肝细胞增殖情况、肝组织病理变化及胶原沉积情况，评估肝功能和凝血功能等改善情况，并与单纯BDLSCs或EPCs移植行疗效比较。结果显示，我们成功建立肝纤维化大鼠BDLSCs分选纯化方法和EPCs体外培养体系，两种细胞均具有特征性表型和功能。BDLSCs和EPCs均能成功移植入肝，前者成簇状种植于肝细胞周围，后者迁移至肝内血管周围，主要聚集于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮，并向成熟内皮细胞分化，表达其特异性抗原CD31和 vWF。BDLSCs和EPCs联合移植能促进肝内血管新生和重建、诱导肝细胞增殖和再生、修复肝组织病理损伤、减少胶原沉积及改善肝功能和凝血功能，对大鼠肝纤维化的整体疗效优于单纯BDLSCs或EPCs移植。本项目组采用BDLSCs和EPCs联合移植治疗肝纤维化，在一定程度上避开了两者单独应用的弊端，互补不足，凸显优势，相互作用，起到了双重抗纤维化作用，为肝纤维化治疗的全面性和有效性开辟了新途径，为今后的临床应用提供了理论依据和实践基础。