中药活性成分复方联合BMSCs移植逆转肝纤维化的机制研究

肝细胞外基质(ECM)产生增多及肝细胞坏死减少是肝纤维化发生的关键。肝星状细胞（HSCs)是ECM的主要来源，我们自然基金资助项目已成功构建了经RGD受体介导的脂质体药物载体（RGD-Lip），可靶向诱导HSCs凋亡并一定程度地逆转肝纤维化。中医认为"肝肾同源"、"肾生骨髓，髓生肝"，最新研究也发现，骨髓间充质干细胞（BMSCs）能促进肝细胞再生，且RGD可介导BMSCs降解ECM。故本研究在前期课题基础上，针对促HSCs凋亡及诱导BMSCs定向分化为功能肝细胞两方面，从七味中药单体中筛选并构建经RGD-Lip介导的活性中药复方制剂，在体外共育BMSCs后联合BMSCs 移植，在体内外应用蛋白质组学及基因芯片等分子生物学方法，研究该中药活性成分复方制剂、BMSCs两者分别及协同对HSCs凋亡的诱导、肝细胞再生的促进及对肝纤维化的逆转功效及可能机制。

本研究建立了分离大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）、肝脏巨噬细胞和人脐带血间充质干细胞（hUC-MSCs）的方法及制备氧化苦参碱脂质体的方法，并成功构建四氯化碳（CCl4）和二甲基亚硝胺（DMN）诱导的大鼠肝纤维化模型。.　　在体外细胞水平，我们将氧化苦参碱及氧化苦参碱脂质体分别作用于体外培养的肝纤维化大鼠肝星状细胞后，用蛋白质组学技术检测到两个差异表达蛋白，推测其可能参与诱导肝星状细胞凋亡的信号途径。.　　在CCl4制备的肝纤维化模型大鼠体内，我们观察到氧化苦参碱和BMSCs移植均能有效减轻肝脏的纤维化程度，而且氧化苦参碱能够增强BMSCs移植的抗肝纤维化作用，原因可能与氧化苦参碱促进BMSCs的免疫调节作用有关，表现为移植了BMSCs后，肝纤维化大鼠血清白细胞介素4（IL-4）和IL-10的水平明显升高，而联用氧化苦参碱后，血清IL-4和IL-10升高得更为明显。.　　由于hUC-MSCs相对于BMSCs具有来源广的优点，临床应用前景更为广阔，我们在后续研究中采用hUC-MSCs代替BMSCs，我们在研究中通过激光共聚焦显微镜检测发现，无论是hUC-MSCs移植还是BMSCs移植，只有少量间充质干细胞定植于肝脏，而且氧化苦参碱并没有增加间充质干细胞在肝脏的定植，说明间充质干细胞移植并不是通过在肝脏定植并分化为肝细胞来发挥抗肝纤维化作用。.　　肝脏巨噬细胞包括M1和M2两种亚型，后者具有抗肝纤维化作用。研究发现，hUC-MSCs移植入DMN诱导的肝纤维化大鼠模型后，肝脏M1型巨噬细胞减少，而M2型巨噬细胞明显增多，提示间充质干细胞移植可能通过促进M1型巨噬细胞活化为M2型巨噬细胞来发挥抗肝纤维化作用的。我们建立的hUC-MSCs和肝巨噬细胞体外共培养体系的研究也证实了该结论。体内外的研究还发现，肝脏巨噬细胞的活化（由M1型转化为M2型）伴随着血清和肝组织中IL-4和IL-10的水平的升高，说明间充质干细胞通过分泌IL-4和IL-10对纤维化肝脏发挥免疫调节作用，促进肝脏巨噬细胞的活化，进而发挥抗肝纤维化作用。　　　.　　该研究首次证实间充质干细胞能分泌IL-4，并发现间充质干细胞移植有够有效治疗大鼠肝纤维化，但并不是通过定植于肝脏并分化为肝细胞来实现的，而是通过分泌IL-4和IL-10，促进肝脏M1型巨噬细胞活化为M2型巨噬细胞，发挥抗肝纤维化作用。