Ghrelin对牛卵母细胞体外成熟的调控机制研究

Ghrelin, also known as growth hormone releasing peptide, which participates in the hormone secretion and the regulation of gonadal axis，and also plays an role in vitro maturation of zebrafish，porcine and ovis aries oocytes, but the exact mechanism of action is unclear. This project aims to study the role of Ghrelin in bovine oocyte maturation in vitro and its regulation mechanism. Firstly, mRNA in situ hybridization and immunohistochemistry are used to examine the expression and localization of Ghrelin and its receptor in ovary,followed by adding different concentrations of exogenous Ghrelin, the maturation rate of oocytes to determine its effects on bovine oocytes maturation in vitro;Ghrelin and its receptor antagonist D-lys3-GHRP-6 were added to determine the pathway of Ghrelin on oocyte; effects of Ghrelin on bovine granulosa cells and oocyte steroid hormone ( E2 and P4 ) secretion, cAMP levels, as well as the influence on MPF and MAPK activity, molecular mechanism of its function. The findings will provide important theoretical basis for further explanation of mammalian oocytes maturation in vitro, but also provide powerful technical support for the animal embryo in vitro production, so the project has important academic value and application prospect.

Ghrelin，又名生长激素释放肽，其参与了性腺轴中激素的分泌和调节，并对斑马鱼、猪和绵羊卵母细胞的体外成熟起着重要作用，但具体的作用机制还不清楚，本项目拟围绕Ghrelin在牛卵母细胞体外成熟中的作用及其调控机制进行研究。首先通过mRNA原位杂交以及免疫组化检测Ghrelin及其受体在卵巢中的表达和定位，其次通过添加不同浓度的Ghrelin来确定其对牛卵母细胞体外成熟的影响；通过添加Ghrelin和其受体拮抗剂D-lys3-GHRP-6共培养来确定Ghrelin对卵母细胞体外成熟的作用途径；并进一步研究Ghrelin对牛颗粒细胞和卵母细胞类固醇激素（E2和P4）分泌、cAMP水平以及对MPF和MAPK活性的影响，揭示其作用的分子机制。研究结果将对解释复杂的哺乳动物卵母细胞体外成熟过程提供重要理论依据，同时也为家畜胚胎体外生产提供有力的技术保障，因此本项目具有重要的学术价值和应用前景。

牛卵母细胞体外成熟是一项重要的繁殖生物技术，其可以利用有腔卵泡来获得大量可用的卵子。但是，卵子离开卵泡环境后，脱离抑制因子的作用，自发的恢复减数分裂，引起卵母细胞质和核的成熟不同步，从而造成体外成熟以及发育率较低，因此限制了该项技术的高效利用。本项目主要研究了在哺乳动物繁殖上发挥重要作用的辛酰化的生长激素释放肽（Ghrelin）在牛卵母细胞体外成熟中的作用及其分子调节机制。主要利用荧光定量PCR和免疫组化检测了Ghrelin及其受体（GSHR）在卵母细胞中的表达和定位；研究了不同浓度（0，10，50，100ng/ml）的辛酰化Ghrelin在卵母细胞体外成熟中的抑制作用，筛选了最佳的作用浓度以及作用时间；通过其受体拮抗剂（D-lys3-GHRP-6）添加试验确定了这种抑制作用是通过其受体来实现的；通过Elisa检测了COCs中 cGMP和cAMP的浓度，还检测了培养液中雌二醇E2、孕酮P4以及MAPK的浓度，从而分析了可能的分子作用机制；进一步通过试验，研究了Ghrelin预处理的分段培养对卵母细胞后期发育的影响。结果显示：Ghrelin和GSHR mRNA广泛表达于GV期的卵母细胞以及卵丘细胞中，Ghrelin主要位于有腔卵泡的颗粒细胞以及卵母细胞胞质里，GSHR主要位于卵泡膜上。辛酰化Ghrelin对卵母细胞抑制的最佳作用浓度为50ng/ml，作用时间为6h，GVBD发生率为38.62 ± 0.86%，显著低于对照组69.67 ± 1.67% (p＜ 0.05)，同时添加10ng/ml的受体拮抗剂可有效缓解Ghrelin对卵母细胞的抑制作用。通过Elisa检测COCs中 cGMP和cAMP的浓度表明，COCs中高浓度的cGMP（19.69± 0.81fmol/个）和cAMP(21.25±4.72fmol/个)以及培养液中高浓度的E2（21.11±0.15ng/L）、P4（164.27±4.72pg/ml）和低浓度的MAPK（3.57±0.08ng/ml）抑制了卵母细胞减数分裂的恢复。通过体外受精发现，Ghrelin预处理6小时，对卵母细胞体外发育以及体外受精具有促进作用。本研究结果对解释复杂的哺乳动物卵母细胞体外发育机制具有重要意义。同时，还初步推断Ghrelin能够成为新型的减数分裂抑制剂药物在畜牧业生产上推广应用，具有良好的市场效应和社会效应。