RAD18对结直肠肿瘤生物活性的影响及其机制研究

The E3 ligase Rad18 is a key regulator for the lesion bypass pathway, which plays an important role in genomic stability. However, the status of Rad18 in colorectal cancer(CRC) is not known. In our previous work, we ,for the first time ,showed that RAD18 and rs373572 AA are significantly associated with CRC. In this study , we will assess whether there is some functional difference due to the exprsssion level of RAD18 . Furthermore, we will observe the changes of the downstream genes to further study the mechanism. In this experiment, we will clarify the role of RAD18 in the occurrence and development of CRC and the molecular biological mechanisms. Rad18 is involved in the regulation of CRC cell proliferation, which can be exploited in designing new strategy for the diagnosis and treatment of colorectal cancer.

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）居肿瘤相关死亡病因的第3位,其发生是许多肿瘤相关基因表达失常所致。RAD18作为跨损伤DNA 合成通路中的关键元件，在保持细胞基因组完整性上至关重要。申请人前期在国际上首次证实RAD18的高表达与CRC相关，并发现其rs373572 AA型与CRC的发生、发展及转移具有密切的相关性，具体机制未见报道。为进一步深入前期研究，阐明RAD18在CRC的发生、发展中的作用及其分子机制，本课题组拟通过对大规模临床样本的检测，明确RAD18与CRC的早期诊断、病理分级、临床分期和预后的关系；通过体内、体外实验,明确RAD18不同表达水平对CRC肿瘤细胞生物活性的影响，并进一步探讨RAD18通过PI3K-Akt信号通路参与调控肿瘤生物活性的分子机制。从而为RAD18作为预后评价指标及潜在治疗靶点提供理论依据及实验基础。

目的：进一步明确RAD18在结直肠肿瘤发生、发展的作用及其相关分子机制。.方法：应用免疫组化、实时荧光定量 PCR 、Western blot法检测 50 例结直肠癌组织及对应的正常黏膜组织中RAD18的表达；设计并合成小分子干扰RNA，脂质体转染以抑制人结肠癌HCT116细胞RAD18表达；通过Ki67免疫荧光检测细胞增殖， Annexin V-APC 单染法检测细胞凋亡，流式检测细胞周期，Transwell检测细胞侵袭，并通过裸鼠成瘤检测体内抑制RAD18表达对结肠癌致瘤的影响；western-blot检测Akt 、cyclin D1、MMP2、Caspase-3的表达水平变化。.结果：临床标本检测显示 RAD18在结直肠癌组织中的表达量均高于其在对应的正常黏膜组织中的表达量(P<0.05)。其表达与结直肠癌的淋巴结转移、 肿瘤分期 （I＋II与III＋IV） 及远处转移均有关(P<0.05)， 而与肿瘤部位、 大小、 大体类型、 浸润深度、 组织分化程度、 患者的年龄及性别均无关。细胞功能实验显示HCT116 KD组的细胞增殖率仅为48.6%，较NC（89.2%）明显降低(P<0.01)；细胞凋亡率为6.3%，较NC组4.5%增多(P<0.05)；侵袭96h后，HCT116-KD侵袭细胞数为111±11.41，而NC组为154±17.12，侵袭能力降低(P<0.05)；裸鼠上HCT116 KD组成瘤潜伏期延长，而肿瘤体积和瘤重与对照组比较（P <0.05）均有所降低。与对照组相比，Akt 、cyclin D1在HCT116 KD的表达明显降低，MMP2、Caspase-3的表达没有差异。.结论：抑制RAD18的表达能抑制HCT116细胞增殖、侵袭能力，并诱导细胞凋亡。体内实验表明抑制结肠癌细胞RAD18 表达可以有效抑制肿瘤的生长。.抑制RAD18的表达可以引起Akt及cyclin D1表达水平下调，进而抑制结肠癌细胞的增殖，并诱导其凋亡。