结直肠肿瘤中RegⅣ效应机制的研究

结直肠癌是我国常见恶性肿瘤之一，阐明其发生分子机制对于了解疾病的进程以及开展靶向治疗非常重要。申请者实验室初步证明RegⅣ是结直肠肿瘤发生过程中的关键基因，在癌前阶段（腺瘤、癌/瘤旁组织）高表达，但我们对其功能的了解甚少。本研究主要为了阐明RegⅣ基因在结直肠肿瘤中的确切功能以及实现功能的机制。利用目的基因转染研究RegⅣ细胞内信号通路改变和效应机制，最终为建立基于RegⅣ的结直肠癌早期诊断和靶向治疗提供重要的理论依据。

再生基因Ⅳ（RegⅣ）是结直肠肿瘤发生过程中的关键基因，目前关于RegⅣ在结直肠肿瘤中的生物学功能的研究较少，本课题研究了RegⅣ在结直肠癌中的生物学功能，并对RegⅣ的分子机制进行初步探索。. 首先通过RT-PCR和western bloting方法寻找适合研究的RegⅣ阴性和阳性表达的株结肠癌细胞系。实验结果显示RKO和HT29为RegⅣ阴性表达细胞株，LoVo和CW2为RegⅣ阳性表达细胞株。然后我们分别转染RegⅣ表达质粒到RegⅣ阴性结肠癌细胞系内，通过G418筛选得到稳定表达RegⅣ的细胞克隆分别记为RKOR细胞株和HT29R细胞株，它们的对照组分别记为RKOC和HT29C细胞株。转染RegⅣ干扰质粒到LoVo，同样通过G418稳筛出干扰细胞克隆LoVo-RegⅣ-shRNA和它的对照组细胞克隆LoVo-Ctrl-shRNA。. 获得稳定表达/干扰的细胞克隆后，我们对这些细胞生物学行为进行研究。通过EdU法、xCELLigence系统及CCK8方法检测RegⅣ并无促进细胞增殖的能力；通过流式细胞仪检测细胞周期，发现RegⅣ表达前后细胞周期也无变化；CCK8检测细胞存活率检测发现RegⅣ并无能力抵抗5-FU诱导的凋亡；然而RegⅣ具有促进结肠癌细胞迁移和侵袭的能力。. 我们选用iTRAQ标记的比较蛋白组学方法来进一步探索RegⅣ在结直肠癌细胞的效应机制。用iTRAQ标记的蛋白质组学方法鉴定RKOR和RKOC，HT29R和HT29C中的差异蛋白质，其中RKOR/RKOC鉴定出6个显著下调蛋白和11个显著上调蛋白，HT29R/HT29C鉴定出18个显著下调蛋白和13个显著上调蛋白。通过对筛选出来的差异蛋白质如MAGED2、Galectin-1、LAMP2、HDGF、PLIN3、FLOT1和Plectin 1等表达上调蛋白及PKP3等表达下调蛋白进行分析，我们可以推测他们可能直接或间接地参与了肿瘤的转移和侵袭过程，他们可能均为RegⅣ在结直肠癌细胞的效应分子，并且他们可能通过MAPK/PI3K/Akt、ERK1/2、EMT、PKCδ/c-Src和NF-kB等信号通路完成其生物学效应。此外，在实验中还有一些差异蛋白质属于代谢途径相关的酶类，他们也可能作为RegⅣ在结直肠癌细胞的效应分子，参与氨基酸代谢、糖酵解和脂肪代谢等代谢相关途径。