ROS抑制KLF4/Oct4复合物形成促心包间质细胞向衰老样肌骨母细胞表型转分化的机制研究

Exploring the phenotypic regulation of pericardial stromal cells (PICs) is the research direction of our research team. We had confirmed that the phenotypic transdifferentiation from PICs into senescent-like myofibro-osteoblasts (SLMOs) was the cytological basis of pericardial structure remodeling. However, the mechanism is still not fully understood. Recently, we detected KLF4/Oct4 complexes in PICs, which inhibited SLMOs transdifferentiation and was controlled by reactive oxygen species (ROS). Accordingly, we hypothesized that ROS inhibits the development of KLF4/Oct4 complexes to promote the transdifferentiation of PICs into senescent-like myofibro-osteoblasts, and speculated that it is responsible for pericardial structure remodeling. To test this hypothesis, we will firstly analyze the mechanism of ROS inhibition of KLF4/Oct4 complex by analyzing the regulation of ROS on the expression of KLF4 and Oct4. Secondly, the mechanism of KLF4/Oct4 complex formation will be determined by using fluorescence labeling tracer and protein interaction assay. Thirdly, we will explore the downstream signal pathway regulated by KLF4/Oct4 complex by using high-throughput technique. Fourthly, the effect of "ROS-KLF4/Oct4 complex" pathway on cell phenotypic conversion will be analyzed by means of rescue experiment. Finally, the effect of "ROS-KLF4/Oct4 complex" pathway on pericardial structure remodeling will be confirmed by using in vitro and in vivo models.

探索心包间质细胞(PICs)表型调控一直是本课题组的研究方向，前期我们已证实其向衰老样肌骨母细胞(SLMOs)转分化是心包结构重塑的细胞学基础，但机制还需进一步阐析。新近，我们在PICs中检测到KLF4/Oct4复合物，其能抑制SLMOs转化，并受活性氧簇(ROS)调控；据此提出“ROS抑制KLF4/Oct4复合物形成促PICs向SLMOs表型转分化”的科学假说，并推测其是心包结构重塑的推进器。为验证该假说，我们将通过分析ROS对KLF4、Oct4表达的调控，明确ROS抑制KLF4/Oct4复合物形成的机制；通过荧光标记示踪、蛋白相互作用检测，确定KLF4/Oct4复合物形成的机制;借助高通量技术，获得KLF4/Oct4复合物所调控的下游信号通路；采用拯救实验，逐级分析”ROS-KLF4/Oct4复合物”通路对细胞表型转换的作用；并通过体内外模型进一步阐明该通路对心包结构重塑的推进作用。

本项研究分六部分内容。在第一部分研究中，证实活性氧簇（ROS）诱导心包间质细胞向衰老表型转分化，并破坏KLF4/OCT4复合物的形成。通过特异性体外细胞模型，证实衰老的心包间质细胞促进单个核细胞迁移和粘附，促进胶原等细胞外基质成分的生成、并通过调控金属基质蛋白酶及其抑制因子的表达，促进细胞外基质的沉积，促进钙盐沉积和向骨母细胞表型转分化。在第二部分研究中，采用基因芯片筛选KLF4下游调控信号网络，证实KLF4下游基因主要富集在细胞增生、凋亡、代谢等信号通路，且KLF4能抑制PI3K/AKT信号通路的激活，并抑制心包间质细胞增生和向肌纤维母细胞转分化、增生。检测到富集到PI3K/AKT信号通路的circRNAs host genes包括LPAR3、THBS1、PPP2CA，生物信息学检测表明这三个基因均为KLF4下游调控基因。在第三部分研究中，采用基因芯片筛选OCT4下游调控信号网络，证实OCT4下游基因主要富集在细胞周期进展、增生相关信号通路。其中，OCT4调控基因也富集到PI3K/AKT信号通路，在该通路上差异表达基因有66个，其中包括PIK3R1、PIK3R5、PIK3R6；并且在这三个基因启动子区均检测到OCT4及其假基因POU5F1B潜在结合位点。在第四部分研究中，发现KLF4和OCT4共同调控的信号通路主要集中在细胞周期进展等增生、细胞骨架重排等信号通路。通过体外细胞模型证实，KLF4、OCT4能协同抑制心包间质细胞向衰老表型、肌纤维母细胞表型、骨母细胞表型转分化；并明确KLF4、OCT4能分别调控抗纤维化基因KLF2、KLF5的转录表达。在第五部分研究中，证实衰老心包间质细胞能促进年轻心包间质细胞快速增生，并且肌纤维母细胞和骨母细胞表型标志物mRNA表达上升。另外采用条件培养基连续培养的方式处理间皮细胞，发现其能促进间皮细胞衰老，并通过钙化模型证实衰老的间皮细胞更溶液沉积钙盐。在第六部分研究中，鉴于心包间质细胞是导致心包钙化的细胞学基础，进一步探索心包脱细胞方法，为新型生物材料的研发提供基础，通过体内外实验证实“冻融循环+非离子型去污剂”方法能有效去除心包生物材料中的细胞、细胞核成份等物质，进而降低炎症反应和钙化。并且该方法生物相容性好，对受检细胞无明显的毒性反应。