ROS调控VECs释放exosome促进VICs表型转分化的分子机制研究

Explore between valvular interstitial cells (VICs) phenotypic transdifferentiation has been a research hotspot of aortic valve calcification (AVC) field. New research suggests that valvular endothelial cells (VECs) also regulated VICs phenotypic transdifferentiation, but the mechanism is unclear. Early, we confirm AVC originating factor of reactive oxygen species (ROS) to promote the release of information transfer VECs "truck" exosome, accordingly proposed "ROS regulation of VECs to promote the release of exosome VICs phenotypic transdifferentiation" hypothesis, and speculated that it is to promote the progress of AVC device. To verify this hypothesis, we will adjust the exosome formation routes, clear ROS promote exosome release mechanism VECs; with high-throughput technologies, ROS clear choice for exosome contents; by fluorescently labeled tracer, advantages miRNA detection, clear whether exosome in the VECs, transmission of information between VICs; advantages through functional analysis of miRNAs to determine the molecular mechanisms regulating VICs exosome phenotypic transdifferentiation. Through this research, trying to clarify the role of communication between the VECs and VICs information mechanisms and VECs-exosome for AVC progression.

探索瓣膜间质细胞（VICs）表型转分化一直是主动脉瓣钙化（AVC）领域的研究热点。新研究提示瓣膜内皮细胞（VECs）亦可调控VICs表型转分化，但机制不清。前期，我们证实AVC始发因素活性氧簇（ROS）促进VECs释放信息传递“卡车”exosome，据此提出“ROS调控VECs释放exosome促进VICs表型转分化”假说，并推测其是AVC进展的推进器。为验证该假说，我们将通过调节exosome生成途径，明确 ROS促进VECs释放exosome的机制；借助高通量技术，明确ROS对exosome内容物的选择；通过荧光标记示踪、优势miRNA检测，明确exosome是否在VECs、VICs间传递信息；通过对优势miRNAs的功能分析，确定exosome调控VICs表型转分化的分子机制。通过此研究，力图阐明VECs和VICs间信息交流的机制及VECs-exosome对AVC进展的作用。

钙化性主动脉瓣中瓣膜间质细胞（VICs）表型转化的机制尚未阐明，本研究力图明确活性氧簇（ROS）能否调控瓣膜内皮细胞（VECs）与VICs之间的信息交流、继而调控VICs的表型分化。在本课题第一、二部分研究中，证实ROS通过PI3K-AKT-mTOR通路直接引发VICs自噬，且VICs自噬的发生在氧化应激模型中呈现出浓度、时间依赖式的模式；并且证实ROS通过VECs分泌上清调控VICs分化和生长，并在VECs分泌上清中筛选到高表达miR-22、miR-133a的exosome。在第三部分研究中，证实升高或降低VICs中miR-22的表达，可调控钙化模型中的钙盐沉积及成骨细胞标志物OPN和Runx2的表达；通过生物信息学分析筛选到CAB39为miR-22下游靶基因，其3’非翻译（UTR）区有miR-22结合位点；随后通过双荧光素酶报告基因检测、western blot确定miR-22对CAB39的直接靶向调控作用；通过拯救实验明确miR-22通过调控CAB39的表达进而调控钙盐沉积；采用免疫组织化学、western blot等检测CAB39在钙化性瓣膜中的表达，并进一步证实miR-22通过调节CAB39-LKB1-AMPK-mTOR信号传导通路促进VICs成骨分化；在以上研究的基础上，通过lncRNA芯片检测和瓣膜组织内验证，筛选出miR-22/lncRNA调控网络分子：lnc-MLLT1-2和lnc-C5orf42-2显著下调，lnc-STX6-2，NEAT1和SNORA67显著上调。在第四部分研究中，证实miR-133a的表达在VICs钙化模型中呈时间依赖式下调，并检测到Runx2、SP7、OPN的表达随着时间延长表达升高，到达高峰后又逐渐降低；升高或降低miR-133a的表达，可调控钙化模型中的钙盐沉积及成骨细胞标志物OPN和Runx2；通过生物信息学分析筛选Runx2为miR-133a下游靶基因，其3’UTR区有miR-133a结合位点；随后通过双荧光素酶报告基因检测、western blot确定miR-133a直接靶向调控Runx2的表达。以上研究结果验证了我们所提出的科学假说：“ROS调控VECs释放exosome促进VICs表型转分化”，并分别明确miR-22、miR-133a在VICs表型转分化中的作用和分子机制。