祛瘀法对ABCB1基因启动子甲基化的影响和预防激素性骨坏死的作用机制

糖皮质激素引起股骨头坏死的发病机制尚未完全清楚，现已知激素在体内吸收和细胞内外的分布主要受到P-糖蛋白的调解。本项目组的前期工作显示，编码P-糖蛋白的基因ABCB1异常表现与激素性骨坏死的发生以及瘀证表现相关。这提示临床常用的祛瘀法有可能通过调控ABCB1基因而防治激素性骨坏死。.本研究通过比较外周血和病灶区ABCB1基因的表观遗传差异；用BSP法和RT-qPCR观察祛瘀法降低甲基化而调控基因水平的能力；用罗丹明外排试验检测P糖蛋白的活性；并且从细胞染色、基因表达、免疫组化、组织病理几方面实证祛瘀法对MSCs的成骨保护作用和大鼠模型中预防激素性骨坏死的作用。.研究围绕ABCB1基因启动子甲基化和基因表达水平展开。探讨激素性骨坏死发病的表观遗传机理，以及祛瘀法预防骨坏死的作用机制，对于提高临床诊疗水平，实现中医辨证论治的客观化、规范化具有重要的理论意义和应用价值。

本项目共三个部分，①为激素性股骨头坏死（ONFH）患者基因组DNA甲基化状态及与瘀证的相关性研究，收集了使用激素后ONFH和使用激素后无ONFH的患者各3例，抽取外周血用于RRBS全基因组甲基化高通量测序，在全基因组启动子区共筛选出100个差异甲基化基因，共涉及94个生物学通路，其中13个基因涉及代谢通路。其中TNFRSF1B为100个差异甲基化基因之一，其编码的蛋白为sTNFR2，对TNF-α的有抑制作用，TNF-α在激活破骨细胞，促进血管内凝血等方面发挥重要作用，IL-18可诱导产生TNF-α，且IL-18与凝血有关，为探讨激素性ONFH患者差异基因DNA甲基化状态及其编码蛋白与瘀证的相关性，用ELISA法检测两组血清中sTNFR2和IL-18的浓度，每组各15例，结果发现病例组血清sTNFR2含量明显低于对照组（P<0.05），两组间血清IL-18浓度无统计差异。说明激素性ONFH瘀证可能与TNFRSF1B基因甲基化水平异常增高相关。②探讨祛瘀法对激素性ONFH兔骨髓基质干细胞（BMSCs）生物活性的影响。将新西兰家兔随机分成正常组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组10只。连续干预8周，与正常组对比，模型组空骨陷窝率明显增高，中药高剂量组空骨陷窝率明显低于模型组、中药低剂量组和中药中剂量组。中药高剂量组BMSCs第72h增殖能力和ALP活性明显高于其它4组。成骨诱导14天，中药高剂量组茜素红定量明显高于模型组、中药低剂量组和中药中剂量组，与正常组无统计差异。模型组BMSCs增殖和成骨分化能力下降，中药高剂量组BMSCs增殖与成骨能力明显增强。说明祛瘀法预防激素性ONFH可能与调控BMSCs成骨分化有关。③研究通络生骨胶囊促进新西兰兔激素性ONFH修复的机制。新西兰兔随机分为正常组6只、模型组和中药组（通络生骨胶囊组）各7只，采用内毒素联合甲强龙的方法制备激素性ONFH模型。第16周进行髋关节MRI和组织病理检测以评估建模效果。与正常组相比，模型组的ABCB1和RUNX2的mRNA表达下调、ABCB1的蛋白表达下调、PPAR的mRNA表达上调。与模型组相比，中药组的ABCB1和RUNX2的mRNA和蛋白表达均上调，PPAR的mRNA表达下调。说明中药组促进兔激素性ONFH的修复可能与调节ABCB1、RUNX2、PPAR基因的功能有关。