基于RNA-seq技术研究“祛瘀法”促进激素性股骨头坏死修复的转录调控机制

Steroid-induced osteonecrosis of femoral head (SIONFH) is the pathological process of the bone tissues necrosis due to the frequent or long-term application of glucocorticoid. Until now, pathogenesis of the disease is remained unknown and treatments limited. Recent studies showed, transcriptomics regulation play an important role in development and repair of SIONFH. There are several key gene networks exiting in the transcription of SIONFH for regulating the imbalance or rebalance of bone metabolism, adipogenesis and angiogenesis. The networks cover key genes or proteins in particular signal pathways, includes osteogenesis ones, adipogenic ones, angiogenesis ones and immune related ones. We intend to use the high-throughput RNA-seq analysis for sequencing transcriptomes; obtain the information of all different transcripts (DT) in full range quickly; discover the relationships between the DT and related signal pathways by siRNA technique; verify the transcriptomics regulation of “removing blood stasis” method in disease development. All of these are practical for us to evaluate the mechanism of the disease, of “removing blood stasis” method, and provide a creative approach for drug targets selection of herbs in SIONFH.

激素性股骨头坏死（SIONFH）是长期或大量应用激素导致股骨头内活性成分死亡的病理过程，目前发病机制尚不明确且诊疗方法局限。研究表明，转录组学涵盖的基因转录调控机制或对骨坏死的病变发展与修复起重要作用。SIONFH在转录环节存在关键基因网络可调控骨代谢、脂化及血管化失衡或再平衡，包括成骨、破骨、成脂化、血管化等信号通路的基因或蛋白。本研究拟采用高通量RNA-seq技术进行全转录组测序，全面快速地获取特定状态下组织内所有差异基因的表达信息；结合基因沉默技术研究差异基因与相关信号通路之间的关系；进一步探究“祛瘀法”对疾病发展过程中坏死组织转录组基因的调控机制。试图从转录组学角度研究SIONFH的病变发展，探讨“祛瘀法”促进SIONFH修复的作用机制，为中药防治SIONFH的作用靶点研究提供新思路。

背景：SIONFH发病进程中转录学机制及活血化瘀类中药干预调控基因的作用尚不明确。研究内容：第一部分：SIONFH坏死区骨组织7例、硬化带区5例、股骨颈骨折正常区12例进行测序，筛选表达差异基因，并进行SIONFH患者及股骨颈骨折患者股骨头骨组织RT-qPCR检测。第二部分：PHD3及WFDC1功能验证。第三部分：构建WFDC1全身基因敲除小鼠，及KDM5D条件性敲除小鼠，观察小鼠发育情况，进行SIONFH造模，并给药后观察修复。结果和数据：（1）骨组织RNA-seq测序结果：1）差异基因：SI_NormvsSI_H组，上调基因1465个，下调差异基因741个。SI_ONvsSI_H组，上调基因2424个，下调基因1251个。SI_ONvsSI_Norm组，上调基因1171个，下调基因818个。2）GO通路富集。SI_NormvsSI_H组6811条。SI_ONvsSI_H组共7381条，SI_ONvsSI_Norm组共6548条。3）KEGG通路。主要富集到NF-kappaBsignalingpathway等。4）WGCNA分析差异基因共得到21个模块。5）桃红四物汤单体组分干预hMSCs成骨分化10天时差异基因CA9及SCL7A11变化明显。（2）差异基因功能实验。1）PHD3功能验证。SAL与PHD3亲和力实验，两者之间存在中强度相互作用。SAL可促进原代成骨细胞增殖ALP活性，并通过ERK1/2、JNK、p38以及Samd5通路促进原代成骨细胞分化。SAL干预原代成骨细胞培养液，抑制破骨细胞分化，调控破骨细胞c-Fos、TRAcP、CTSK、MMP9等关键基因，抑制NFATc1等相关蛋白。2）WFDC1功能验证。人及家兔SIONFH坏死区WFDC1mRNA高表达。WFDC1蛋白可诱导内皮细胞迁移，加速管腔形成。WFDC1蛋白可诱导ERK1/2的磷酸化P38和JNK、Akt。刺激过程中，p-JNK/JNK升高后降低，ERK1/2磷酸化ERK1/2蛋白表达率比和p-p38/p38细胞比值均上调。ALP、茜素红染色，WFDC1干预的成骨细胞ALP活性和钙沉积增加。科学意义：利用RNA-seq测序技术为构建立体完善的股骨头坏死的发生、发展体系脉络构建了良好的基础，为SIONFH早期诊断提供条件，并为筛选中药单体等小分子药物，从而为研发治疗SIONFH药物提供支撑。