桔小实蝇中多杀菌素受体蛋白的鉴定及抗性分子机制研究

Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel), is one of important destructive pests on fruits and vegetables, it took serious damage in south China over the past decade. Spinosad is one of the main pesticides for current prevention and controlling its outbreak. Existing reports and our preliminary results have indicated that B. dorsalis can develop strong resistance to spinosad. However, mechanisms of insecticide resistance to spinosad in B. dorsalis were still remain unclear. It will be not conducive to extend the service life of spinosad and make integrated resistance management. This proposal is planning to establish spinosad resistance and susceptible strains of B. dorsalis by selection procedure. Then the responsive proteins of B. dorsalis to spinosad will be separated and identified by the application of proteomics technologies and bioinformatics methods. Moreover, protein to protein interaction will be explain by using Gene ontology, and some key proteins will be tested and verified. In addition, inhibitor and analogues related to target role are verified in original population of B. dorsalis and a clear biological effects would be displayed. Our results will reveal toxic effects of spinosad, and help us to find a new role for pesticide target to enrich the content of insect toxicology, as well as pave a better way for insecticide resistance management of B. dorsalis or other aspects. All informations are both theoretical and practical significance for insecticide resistance of B. dorsalis.

桔小实蝇是我国果蔬业的重大害虫，近十多年来在华南地区为害甚烈。多杀菌素是当前防治桔小实蝇的主要杀虫剂之一。现有的报道和申请人的前期工作表明，桔小实蝇能对多杀菌素产生较强的抗药性，但对其抗性机制的了解并不十分明确。这不利于延长多杀菌素的使用寿命和进行抗药性治理。本项目拟通过抗性选育的方法建立桔小实蝇对多杀菌素的抗、感品系；应用蛋白质组学技术和生物信息学方法，分离和鉴定桔小实蝇对多杀菌素的受体蛋白；利用基因本体论方法对已鉴定蛋白的相互作用进行分析，并对关键蛋白进行检验和验证；以靶标作用的相关抑制物或类似物处理原种群，明确其对桔小实蝇种群的生物学效应。研究结果将从蛋白质水平揭示多杀菌素的毒性效应，并为杀虫剂寻找新的作用靶标，充实昆虫毒理学内容，以及更好的治理桔小实蝇的抗药性等方面均具有重要的理论和实践意义。

阿维菌素作为当前防治桔小实蝇首先杀虫剂，其抗药性问题备受关注。国内外对这类问题的研究也很重视，我们针对其抗性机制不明确的问题，开展了利用一系列研究。首先，我们研究了温度、饲养密度、测定密度、日龄、性别和寄主食料等因素对桔小实蝇的药剂敏感性影响，表明温度在25±2 ℃，幼虫饲养密度在10-13粒/g人工饲料，药膜法毒力测定密度在40-60头/L，选4日龄雌成虫或雄成虫作为测试虫，以及选用以香蕉和酵母等配制的人工饲料作为寄主饲料，能够获得较为稳定的药剂敏感性测定结果，统一了本项目中所用桔小实蝇抗药性的判断标准；筛选建立了桔小实蝇对多杀菌素抗性品系以及相对敏感品系，相对敏感品系和抗性品系对多杀菌素的LC50分别为1.78mg/L和15.56 mg/L，两者抗药性系数达16.38；完善和优化了桔小实蝇蛋白提取、分离和鉴定的方法，表明了使用 24 cm pH 4~7 的IPG 胶条对 BPP 法提取的桔小实蝇幼虫总蛋白进行双向电泳，并采用考马斯亮蓝法对双向电泳凝胶进行染色，可得到更好的双向电泳图谱，检索数据库时检索物种可优先设为 Metazoa (Animals)；分别分离和鉴定桔小实蝇对多杀菌素瞬时和长时响应蛋白，以T检验值小于0.05且蛋白表达量变化2倍以上或0.5倍以下作为蛋白上调或下调表达的标准，找到了54个差异蛋白点并进行了质谱鉴定，成功鉴定出了42个蛋白，其中17个表达量上调，25个表达量下调；鉴定成功的蛋白按功能分为物质能量代谢相关蛋白、免疫反应相关蛋白、神经系统发展相关蛋白、细胞骨架蛋白以及其它蛋白；多杀菌素作用导致桔小实蝇体内糖代谢作用、蛋白代谢作用、能量代谢作用等均发生了改变，显示它们参与了桔小实蝇对多杀菌素的响应活动。热激蛋白及细胞骨架蛋白也可能参与响应过程；并进行了WEGO分析，最后通过酶活法验证谷胱甘肽-S转移酶和多功能氧化酶主要功能蛋白。这些研究结果对于更好的治理桔小实蝇对多杀菌素的抗药性、延长多杀菌素的使用寿命等方面具有重要的理论和实践意义。在本项目的资助下，已发表SCI论文2篇，中文核心论文1篇，申请专利1件，培养硕士研究生1名。