铁氧还蛋白在梭菌丁醇发酵过程中介导的电子传递机制研究

Clostridium acetobutylicum是革兰氏阳性严格厌氧菌，在丁醇生成过程中，电子传递给NAD(P)，或铁氧还蛋白(Ferredoxin, Fd)，决定菌株产丁醇或者产氢。但是电子是如何从Fd传递给NAD(P),尚不清楚，催化该反应的关键酶即Fd-NAD(P)还原酶(FNR)在梭菌中尚未报道，而这一过程是决定丁醇产量的关键因素之一。为探讨FNR介导的电子传递机制，本研究利用已有的全基因组序列，通过生物信息学分析，筛选可能编码FNR的基因，通过靶基因的体外表达、产物的分离与纯化以及酶活性分析等手段获得FNR；然后运用实时荧光反转录(RT)-PCR对FNR及产溶剂关键酶的基因转录水平进行跟踪分析，确定影响产溶剂过程的关键基因。通过对FNR的研究揭示其在梭菌电子传递和分配中的作用，以及Fd在丁醇发酵过程中的电子传递机制，为丁醇发酵调控提供理论基础。

随着化石能源的日益枯竭，利用生物发酵法生产生物燃料逐渐受到人们的重视。丁醇具有良好的燃烧性能，其能量密度接近汽油，能够以任意比例与汽油混合，因此与其他生物燃料如乙醇等相比，更适合作为液体燃料。而发酵原料和菌株生产能力一直是困扰生物丁醇工业化生产的瓶颈问题。Clostridium acetobutylicum 是革兰氏阳性严格厌氧菌，在丁醇生成过程中，电子传递给NAD(P)，或铁氧还蛋白(Ferredoxin, Fd)，决定菌株产丁醇或者产氢。但是电子是如何从Fd 传递给NAD(P)，尚不清楚，催化该反应的关键酶即Fd-NAD(P)还原酶(FNR)在梭菌中尚未报道，而这一过程是决定丁醇产量的关键因素之一。本课题利用离子交换层析和凝胶过滤层析从丙酮丁醇梭菌中纯化得到了Bcd/EtfAB酶复合物，该酶复合物由丁酰-CoA脱氢酶和电子传递体EtfA和EtfB组成，SDS-PAGE显示分子量分别为41、36和28KD。酶活检测发现，由Bcd/EtfAB酶复合物催化的巴豆酰-CoA向丁酰-CoA的转化，耦合了NADH的氧化及Fd的还原，比酶活为0.4 U/mg（NADH氧化反应）；另外，Bcd/EtfAB酶复合物可以催化TTC（triphenyltetrazolium chloride，含有两个电子的人工电子受体）的还原反应及二茂铁六氟磷酸（ferrocenium hexafluorophosphate，含有一个电子的人工电子受体）的还原反应，比酶活分别为0.35 U/mg和0.14 U/mg。同时，在丙酮丁醇梭菌中首次发现Bcd/EtfAB酶复合物可以催化NAD+的还原反应，并且该反应与Fd的氧化相耦合，比酶活为0.13 U/mg，但未涉及丁酰-CoA的氧化。使用不同的方法对木糖渣进行预处理，分析处理前后木糖渣的组成变化并比较了糖化效果。一株高产菌株Y-3，氢氧化钙脱毒处理木糖渣水解液的还原糖含量为49.3 g/L，丁醇和ABE产量在发酵96 h后分别达到5.6 g/L和9.9 g/L；补充水解液糖量至60 g/L后，在发酵48 h后，丁醇和ABE产量分别为 8.2 g/L和16.0 g/L，表明影响该水解液ABE发酵的主要因素是培养基中较低的葡萄糖浓度。