与死亡结构域蛋白TRADD\FADD\RIP1互作的牛分枝杆菌蛋白的鉴定和功能研究

Mycobacterium bovis (M. bovis), the causative agent of tuberculosis in a range of animal species and human, has the ability to inhibit tumor necrosis factor (TNF) mediated apoptosis. Trimerization of TNFR1 by TNFα brings together the TNFR1 to recruit TNFR1-associated death domain protein (TRADD), FAS-associated death domain protein (FADD) and receptor-interacting protein 1 (RIP1), which in turn activates or blocks apoptosis and necrosis through protein interactions and modifications. Dependent of this signaling pathway, are there any M. bovis proteins involved in the formation of appoptosis-inducing complex, triggering subsequent cell death? Thus, potential M. bovis proteins that interact with TRADD, FADD or RIP1 will be screened by yeast-two-hybrid system from a random genomic library. Candidate proteins will be further characterized by expression, pull-down and blotting using molecular and immunological bio-techniques to reveal whether these proteins are essential for TNF mediated apoptosis. Apoptosis inhibition by M. bovis proteins toward THP-1 cells will be demonstrated in the nonpathogenic Mycobacterium smegmatis. Dynamic modifications that include phosphorylation, acetylation, and multiple forms of ubiquitination of target proteins will be analyzed to evaluate their interplays in downstream signaling pathways. This will provide insight into the interactions between DDs and M. bovis proteins as a trigger of apoptosis or necrosis signaling.

牛分枝杆菌是重要的人畜共患病原菌并能抑制肿瘤坏死因子（TNF）介导的细胞凋亡。 TNF可以使其受体TNFR三聚化并招募死亡结构域相关蛋白TRADD、FADD和RIP1形成凋亡诱导复合体，从而导致细胞凋亡的发生。那么，牛分枝杆菌中哪些蛋白参与了凋亡诱导复合体形成的调控呢？因此，本项目拟从TNF信号通路中三个重要的效应蛋白TRADD、FADD和RIP1入手，通过酵母双杂交技术，筛选可与其互作的牛分枝杆菌蛋白，进而通过原核表达和免疫印迹等分子生物学和免疫学手段，研究牛分枝杆菌蛋白对细胞凋亡的抑制作用，然后通过突变分析、蛋白互作、免疫共沉淀等方法系统研究所筛选的牛分枝杆菌蛋白对TRADD和FADD寡聚化以及RIP1磷酸化、泛素化的影响，进一步阐明其在TNF介导的细胞凋亡信号传导中的作用和机制。本研究为揭示死亡结构域相关蛋白在牛分枝杆菌感染引起的凋亡中的作用提供理论基础和实验证据。

牛分枝杆菌是重要的人畜共患病原菌 ，可通过抑制TNF介导的细胞凋亡来促进细菌的增殖和扩散，逃避树突状细胞等抗原递呈细胞对分枝杆菌抗原的递呈，延缓机体获得性免疫反应的发生。与之相反，经传代致弱的牛分枝杆菌BCG则可促进细胞凋亡的发生，激活更强烈的获得性免疫反应。然而，牛分枝杆菌强毒株抑制细胞凋亡的机制还不清楚。. TNF可以使其受体TNFR三聚化并招募死亡结构域相关蛋白TRADD、FADD和RIP1形成凋亡诱导复合体，从而导致细胞凋亡的发生。那么，牛分枝杆菌中哪些蛋白参与了凋亡诱导复合体形成的调控呢？本项目首先通过酵母双杂交技术，使用TNF信号通路中三个重要的效应蛋白TRADD、FADD和RIP1筛选了牛分枝杆菌基因组文库，经回补验证、测序分析、Blast比对以及CO-IP验证，最终发现了与TRADD和FADD均互相作用的牛分枝杆菌蛋白PPE13，以及与RIP1互作的PE16、sseB、Mb0869c和Mb0383c。再次，探讨了PPE13牛分枝杆菌PPE13蛋白对TNF介导的信号通路的影响。在TNF介导的NF-κB活化以及细胞凋亡模型中， PPE13不仅抑制TNF引起的NF-κB下游因子IκB的降解和磷酸化的形成，还抑制由TNF和CHX引发的细胞凋亡的发生。另外，PPE13也抑制耻垢分枝杆菌引起的细胞凋亡，但同时促进细胞焦亡的发生。最后，构建了TRADD过表达引起的细胞死亡的模型，并通过该模型确定了与RIP1互作蛋白中PE16、sseB和Mb0383c可抑制细胞死亡的发生，其中Mb0383c的抑制作用最强。. 总之，通过本项目的研究，我们发现了牛分枝杆菌中参与抑制细胞凋亡的相关蛋白，为进一步探索牛分枝杆菌感染机制提供了理论基础。