真菌蛋白激发子PevD1与烟草互作受体蛋白的鉴定及功能研究

Elicitor-inducing plant immunity is one of the important strategies in biological control of plant diseases. Plant perception of elicitors is the key to initate plant immune signal transduction responsible for elicitor-induced resistance in plants.Despite the importance of patten recognition receptors(PRRs) in plant immunity, the vast majority of PRRs remains to be identified. PevD1 (Protein elicitor from Verticillium dahliae), a novel protein elicitor isolated from the culture filtrate of cotton Verticillium wilt pathogenic fungus, could induce hypersensitive response and systemic acquired resistance to tobacco mosaic virus (TMV)in tobacco plants. The research results have been applied for a national invention patent (201010593488.5). As the perception mechanism between PevD1 and tobacco is unclear, we use yeast two-hybrid system and isotope labeling technique to screen receptor potein of PevD1 in tobacco, with GST pull-down, bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and surface plasmon resonance (SPR) to test the interaction with PevD1 in vitro and in vivo, with virus-induced gene silencing (VIGS) and tobacco genetic transformation to study the function of the receptor protein in PevD1-induced resistance. This research will provide theortic foundation for understanding the signaling pathway of PevD1-induced defense responses in plants.

激发子诱导植物抗病性是植物病害生物防治的重要途径之一。植物受体对激发子的识别（结合）是触发植物免疫信号传导的开关，尽管植物上的受体对揭示植物免疫机制至关重要，但目前大部分受体并没有鉴定。PevD1是申请团队从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）中分离到的一个新蛋白激发子，具有激发烟草防御反应和提高对TMV系统抗性的功能，相关研究已申请一项国家发明专利（201010593488.5）。由于该激发子与烟草的识别机制尚不清楚，本项目拟用酵母双杂交系统和同位素标记技术筛选PevD1在烟草中的互作蛋白，用GST pull-down、双分子荧光互补技术（BIFC）和表面等离子共振（Biacore）技术等对候选互作蛋白进行细胞体内和体外验证；利用病毒诱导基因沉默（VIGS）和转基因技术研究互作蛋白在PevD1激发烟草抗病反应中的作用，为深入了解PevD1诱导植物抗病机制提供理论依据。

植物在长期进化过程中形成了复杂的免疫系统以抵御病原菌的侵染，植物识别病原菌产生的激发子是激发植物免疫的关键环节。PevD1是大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）分泌的蛋白激发子，前期研究证明，该激发子能引起烟草细胞坏死，激发烟草免疫防御反应，提高系统抗病性，但其作用机制尚不清楚，鉴定蛋白激发子在植物细胞中的靶标蛋白对揭示激发子的作用机制具有非常重要意义。在本基金项目的资助下，完成人首次利用酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光标记互补（BIFC）等技术鉴定了烟草中PevD1的一个互作蛋白，命名为Nbnrp1。Nbnrp1在烟草根、茎和叶以及不同生长发育阶段均有表达，定位在烟草细胞核和细胞质中。烟草细胞瞬时表达分析也证明，Nbnrp1和PevD1能共定位在同一个烟草亚细胞器中。利用Y2H和Pull-down 蛋白互作技术研究证明了Nbnrp1的DCD结构域是两个蛋白互作的功能片段。为了进一步研究Nbnrp1互作蛋白在激发子PevD1诱导烟草免疫防御反应中的作用，利用转基因技术获得了互作蛋白Nbnrp1的过表达株系和RNAi烟草株系。与野生型植株比较，过表达株系增强激发子PevD1诱导的细胞坏死，提高对TMV和假单胞菌的抗性；而Nbnrp1沉默植株对PevD1诱导的细胞坏死反应程度降低，抗病性减弱, 抗病基因PR1-a，PR1-b转录表达水平降低。说明Nbnrp1蛋白参与了蛋白激发子PevD1诱导的烟草免疫反应和系统抗病性。该研究结果为进一步揭示PevD1诱导烟草抗病机制以及大丽轮枝菌与寄主互作机制奠定了基础。