多价氟代膦酸扎那米韦的合成、抗流感活性研究及在病毒快速检测中的应用

Disease burden due to influenza is significant especially new pandemic H7N9 avian Flu in January 2017. Recently two Tamiflu resistant strains were isolated which make it an urgent need not only to develop new structure antiviral drugs but also monitor the surveillance. In this proposal, three effective structure modifications which can enhance the antiviral activity were combined together into Zanamivir backbone to get a serial of multivalent fluorinated zanamivir phosphonate analogs. Chemical biology technologies were used to further study the binding between neuramidinase on the virion and the analogs on molecular, protein, cell and animal level which can give the basic principles for the rational design of neuramidinase inhibitor and set up a platform for the evaluation of the antiviral compounds. Furthermore, the synthetic Zanamivir analogs which have high binding affinity to the influenza virus were attached on the microarray, surface plasmon resonance and nanorod sensor surface to develop rapid point of care diagnostics for all influenza strains especially for the drug resistance strains. This small molecule based technologies were expected to overcome the limitations of antigen detection assays and will guide clinical drug use.

2017年初爆发的H7N9禽流感及在患者体内分离的两株耐达菲毒株，对研发新型抗流感药物与流感及时监控提出了迫切要求。针对流感耐药株与神经氨酸酶（NA）抑制剂结合力降低进而体现出的耐药性，本项目以上市药物扎那米韦为母体，综合三种有效提高与NA结合力的改造策略，设计了一系列多价氟取代膦酸基扎那米韦衍生物，用以提高与耐药株NA的结合，解决毒株耐药性。对筛选出的抗流感活性最优的化合物，使用多种化学生物学手段对耐药机制及NA的结合进行分子机理研究，期望在寻找高活性神经氨酸酶抑制剂的同时，为理性设计抗流感药物提供实验依据。更进一步，将合成的与流感病毒具有高亲和力的化合物与微阵列芯片、表面等离子体共振、金纳米棒技术相结合，发展基于小分子的流感病毒尤其是耐药毒株的快速检测体系，改善原有基于抗原抗体相互作用的试剂盒的稳定性差、灵敏度低的缺点，指导临床合理用药。

每年冬春季节流感爆发及临床耐药株的不断出现，对流感快速检测与发展新型抗流感药物提出了迫切要求。在充分总结构效关系的基础上，本项目在化学合成方面建立了唾液酸C-3位氟及C-1、C-2位膦取代的氨基及胍基唾液酸类似物的合成方法。使用人血清白蛋白、牛血清白蛋白通过无铜催化点击化学反应对上述合成的唾液酸单体进行了多价修饰，并建立了使用MALDI-TOF进行蛋白表面小分子偶联量的方法。更进一步使用多聚马来酸酐，对单体唾液酸进行了高聚偶联修饰，并使用排阻色谱法，确定了高聚物表面唾液酸单体偶联量，为后续的抗病毒活性定量研究奠定了基础。生物学活性方面，利用本课题组建立的抗流感活性评价体系，对上述化合物在病毒及细胞水平进行了抗病毒活性评价及机理研究。结果表明，氟、膦取代及多价修饰能够不同程度地增强化合物与血凝素、神经氨酸酶的亲和力。尤其是对合成的唾液酸单体经过多价修饰后，能够几何级数地增强与病毒表面两种蛋白的结合，进而增强抗病毒活性。深入的机理研究表明，多价缀合物不仅能够抑制血凝素和神经氨酸酶的活性，亦能够通过表面的唾液酸类似物对流感病毒进行捕获，进而聚集流感病毒颗粒，干扰流感病毒复制的前期和后期。上述作用的叠加效果使得制备的高聚物对于流感耐药株显示出了纳摩尔级别的抑制活性。本项目的成功实施，为唾液酸的选择性氟膦修饰、小分子与大分子的正交偶联、大分子表面活性小分子偶联数目的确定、抗流感病毒活性平台的建立以及机制研究均奠定了理论和实验基础。同时也为后续进一步扩展相关化合物的种类，深入研究流感病毒抑制剂的构效关系，开发新型的抗病毒药物提供范例。