水稻条纹病毒NS3蛋白的磷酸化修饰在维持病毒与介体互作稳态中的功能解析

Rice stripe virus is a significant viral pathogen that cause big reduction or failure of rice production every year, and the small brown planthopper (SBP) is critical for the occurrence and epidemic of rice stripe disease. Traditional pest control strategyby pesticide could cause many negative effects. Therefore, new preventive strategies are needed. During the long time co-evolution, the interaction balance between the planthopper-borne virus and the transmission vectors already have achieved, and that breaking the balance and interfering with the virus transmission of vector will be the major method of controlling planthopper-borne virus caused disease. In our study, previous result showed that NS3 protein could be phosphorylated by total protein extracts of four plant host and transmission vector in vitro. we want to further determinate the actual phosphorylation site of NS3 protein and the corresponding kinase in vivo by bioinformatics and molecular biology, and then screening the host binding factors of NS3 protein in small brown planthopper using the NS3 phosphorylation mimic or de-phosphorylation mutants as bait by yeast two-hybrid assay and Co-IP analysis. At last, further to validate the biological functions of phosphorylation for sustaining the balance between RSV and SBP by silencing of these host factors. We are looking forward to understand the molecular mechanism of the biological functions of the phosphorylation of NS3 in counteracting vector’s RNAi pathway. Our research supplied theoretical basis for the prevention and controlling of planthopper-borne virus.

水稻条纹病毒(RSV)是造成水稻大面积减产甚至绝收的重要病毒，而介体灰飞虱对于RSV的田间发生及流行非常重要。传统的“治虫防病”的策略会造成许多的负面效应，因此亟待有新的防控方法。在长期的共进化过程中虫传植物病毒与介体间的互作已经形成平衡，打破平衡稳态干扰介体传毒将会是未来控制虫传病毒病的主要策略。本研究在前期确定RSV的NS3蛋白能被多种植物寄主和介体灰飞虱总蛋白提取物磷酸化的基础上，希望通过生物信息学、分子生物学手段分析确定NS3蛋白在介体灰飞虱中磷酸化位点和磷酸激酶种类，同时筛选与NS3模拟磷酸化和去磷酸化突变体蛋白互作的介体因子，并通过饲喂双链沉默该因子来验证磷酸化对于维持病毒与介体互作平衡稳态的作用，及对后续传毒的影响。以期在分子层面理解NS3蛋白的磷酸化在对抗介体RNAi过程中功能发挥的分子机制。研究结果为虫传植物病毒的防控提供新的理论依据。

水稻条纹病毒 (Rice stripe virus, RSV) 侵染水稻后引起水稻条纹叶枯病，病害严重时造成水稻减产甚至于绝收，被称之“水稻癌症”。磷酸化修饰在真核生物的生命过程中扮演着非常重要的作用。本研究针对RSV编码的NS3展开研究，前人发现该蛋白是典型的基因沉默抑制子，在植物细胞中能均匀的分布于细胞核与细胞质中，而其在飞灰虱血淋巴中含量最高。猜测NS3可能与RSV的致病性及介体传毒有关。.在本研究中，通过体外磷酸化实验，确定了其能被寄主植物和介体总蛋白磷酸化。通过磷酸化预测软件、模拟磷酸化与去磷酸化突变体的构建，在烟草中测试了不同潜在磷酸化位点突变体的基因沉默抑制活性。实验结果表明Y168D和S170D 抑制子活性基本消失，而Y168F和S170A 均还存在较强抑制子活性。同时亚细胞定位实验发现，Y168F和S170A 均是核质分布，而Y168D主要分布于细胞核，S170D则不进细胞核。综上，寄主植物通过磷酸化修饰Y168和S170位点来调节NS3蛋白的核质穿梭，影响其抑制子活性，调节病毒的致病性和传播力。.通过体内磷酸化实验，商业化磷酸化特异性抗体，LC-MS/MS技术确定了NS3蛋白的168 及170 位氨基酸确实能被磷酸化修饰。通过酵母双杂交筛选、BiFC、Co-IP、GST-pull down确定了水稻激酶CIPK29能与NS3直接互作。通过体外磷酸化实验，明确了NS3蛋白的168 及170 位氨基酸确实能被CIPK29磷酸化，且CIPK29的196位、200位、203位均与其活性密切相关。该激酶的活性能被激酶抑制剂JANEX-1、ST-271、JNJ-10198409、AG490所抑制。.综上，RSV侵染水稻后，其编码的NS3蛋白能与水稻的CIPK29发生直接互作，进而调节NS3蛋白的Y168/S170位点的磷酸化状态，影响了NS3蛋白的结构，使得磷酸化氨基酸附近的核定位信号173KKR175与核转运蛋白间识别的难易程度发生变化，进而导致NS3蛋白的亚细胞定位异常，异常的亚细胞定位决定了NS3蛋白的基因沉默抑制能力发生变化，最终影响RSV的致病性及传毒能力。该研究首席揭示了水稻病毒与寄主长期共进化中的互作平衡，病毒通过劫持寄主植物的激酶，通过磷酸化修饰来调节病毒的致病性，保证病毒与寄主长期稳定互作稳态，有利于病毒传代及长期存活；