水稻条纹病毒Pc2蛋白在病毒侵染介体中的功能研究

Rice stripe virus (RSV) is transmitted by the small brown plant hopper (SBPH) in a persistent-propagative manner. So, to interrupt vector-mediated virus transmission is an effective means to control rice stripe disease epidemic. However, the mechanism of RSV transmission has not been clarified so far. It was indicated in our previous research that RSV Pc2 was a membrane protein and localized in endoplasmic reticulum of insect cell. Therefore, Pc2 is suggested as a critical factor for RSV to infect insect cell based on the functions of its homologous proteins and the results of our previous study on Pc2. So, this program plans to study the functions of RSV Pc2 protein during virus infection in its insect vector. Firstly, the RNA interference technology is used to knock down the expression of Pc2 to analyze the influence of inhibition of Pc2 on the efficiency of virus transmission. Based on above results, we can know whether Pc2 protein is involved in virus transmission. Then, it is analyzed which infectious steps are affected by the inhibition of Pc2 in both cultured cells and bodies of SBPHs to clarify in further the specific functions of Pc2 during virus infection in its vector . Finally, the proteins of SBPH that interact with Pc2 are screened and these interacted proteins are examined their subcellular localization by immunofluoresence and analyzed their functions in the viral transmission. Based on above works, we aim to illuminate the functions of Pc2 and its interacted factors in vector during virus infection in insect vector, which will provide the theory basis for RSV-resistance gene engineering.

水稻条纹病毒(RSV)依靠灰飞虱以持久增殖方式传播，因此阻断病毒的介体传播途径是防控该病毒病害的一种有效手段。但是，目前RSV的介体传播机制还未阐明。我们前期的研究结果表明RSV Pc2蛋白为膜蛋白，定位于昆虫细胞内质网，结合同源蛋白功能推测其为病毒侵染介体的关键因子。因此，本项目拟开展Pc2蛋白在病毒侵染介体中的功能研究。首先利用RNA干扰抑制Pc2蛋白的表达，分析Pc2表达的抑制效果和介体传毒效率的关系，明确Pc2是否参与了介体传毒。随后，分别在细胞和虫体水平上分析Pc2的抑制影响了病毒侵染介体过程的哪一步，进一步探明Pc2在病毒侵染介体中的具体功能。然后，筛选与Pc2互作的灰飞虱蛋白，对互作蛋白进行亚细胞定位，并研究这些蛋白如何通过与Pc2互作而在病毒侵染介体中起作用的。通过本研究以期阐明Pc2蛋白以及与其互作的介体因子在病毒侵染介体中的功能，为开展抗病毒基因工程研究提供理论依据。

水稻条纹病毒(RSV)依靠灰飞虱以持久增殖方式传播，因此阻断病毒的介体传播途径是防控该病毒病害的一种有效手段。我们前期的研究结果表明RSV Pc2蛋白为膜蛋白，定位于昆虫细胞内质网，结合同源蛋白功能推测其为病毒侵染介体的关键因子。因此，本项目开展了Pc2蛋白在病毒侵染介体中的功能研究。首先分析了Pc2蛋白的细胞毒性作用，结果表明Pc2蛋白在大肠杆菌中表达能够抑制菌体的生长，在昆虫细胞中表达降低了细胞的存活率，表明Pc2蛋白对细胞具有毒性。然后通过RNA干扰抑制Pc2蛋白的表达，分析Pc2表达的抑制效果和介体传毒效率的关系，结果显示，抑制Pc2蛋白的表达能够降低介体传毒效率，明确了Pc2蛋白参与了介体传毒过程。随后，构建了灰飞虱酵母双杂交文库，利用Pc2为诱饵筛选到了8种与Pc2互作的灰飞虱蛋白，分别为NF-X1型锌指蛋白、糖转运体1、热激蛋白70、硫辛酰基转移酶1、DnaJ同源超家族B家族类6B、肌动蛋白1、60s核糖体蛋白L14和一种保守的分泌蛋白。进而选取3个可能与介体传毒相关的蛋白（糖转运体LsST1、热激蛋白LsHSC和肌动蛋白LsAT）进一步研究。双分子荧光互补实验证实RSV Pc2与LsST1、LsHSC、LsAT间均存在互作。细胞共定位结果显示，在昆虫细胞中RSV Pc2与LsST1仅有部分的共定位，而与LsHSC和LsAT几乎完全共定位，进一步说明RSV Pc2能够与3种蛋白互作。最后分析了RSV Pc1的内切酶活性，结果表明RSV Pc1具有依赖于Mn2+的核酸酶活性，能够降解RNA，并进一步确定了酶活性的四个关键位点（D547，D567，E585和K604），为进一步明确RSV的转录机制奠定了基础。通过本项目的研究工作明确了Pc2蛋白在病毒传播中的作用以及与其互作的灰飞虱蛋白，为进一步阐明Pc2蛋白与介体因子互作调控病毒传播的机制奠定了基础，为开展抗病毒基因工程研究提供了理论依据。