基于NE/ADRB2/NGF/TrkA正反馈环路探讨逍遥散抑制肝内胆管癌的效应及分子机制研究

How to inhibit intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) is an urgent problem in the treatment of primary hepatic malignancy. Our previous studies have shown that NE/ADRB2/NGF/TrkA regenerative feedback loop between neuronal and cancer cells played an important role in the development and progression of ICC. Xiaoyaosan (XYS) has been approved for treatment of hepatic and gall diseases, and it has been proved to be able to reverse the clinical symptoms of patients with liver depression and qi stagnation (sympathetic hyperactivity, mental depression, emotional unrest). Our pre-experimental found that XYS combined with gemcitabine can effectively inhibit the transplanted tumor inoculated by neuronal cells and ICC cells in vivo while reduce effective the expression of ADRB2, NGF in cancer cells and TrkA, NE in neuronal cells, respectively. However, the underlying mechanism is unclear. In this study, we will (1) use ingenious animal and cell model to confirm the inhibitory effect of XYS combined with gemcitabine on ICC; (2) use various molecular biological methods combined with genetic techniques to study the relationship between the inhibitory effect of XYS on ICC and its regulation on NE/ADRB2/NGF/TrkA regenerative feedback loop; (3) use pathway inhibitor/agonist to explore the regulation mechanism of XYS on NE/ADRB2/NGF/TrkA regenerative feedback loop between neuronal and cancer cells. Our project will elucidate the effect and molecular mechanism of XYS on ICC, and will provide scientific basis for the drug curative combination of XYS and gemcitabine on ICC in clinical.

如何抑制肝内胆管癌（ICC）是临床肝恶性肿瘤治疗领域亟待解决的难题。课题组的研究及已有报道显示，神经元细胞-癌细胞间NE/ADRB2/NGF/TrkA正反馈环路在ICC发展恶化进程中至关重要。逍遥散（XYS）在临床被广泛用于肝胆疾病治疗，被证实能逆转肝郁气滞患者的临床症状（交感神经偏亢、精神抑郁等）。前期预实验发现，逍遥散联合吉西他滨在体内可有效抑制神经元细胞与癌细胞共同接种的移植瘤，同时能下调条件培养基诱导的ADRB2、NGF（癌细胞中）和TrKA和NE（神经元细胞中）水平，但机制不明。本项目拟在体内外水平对逍遥散联合吉西他滨抑制ICC的效应进行确证；运用分子生物学手段，挖掘逍遥散对神经元细胞-癌细胞间正反馈环路的调节作用与其抑制效应的相关性；采用通路调节剂探讨逍遥散调控该通路的分子机制。本项目有助于揭示逍遥散对ICC的抑制效应及分子机制，为其与吉西他滨联合治疗ICC的应用提供药理学依据

（1）项目的研究背景：肝内胆管癌死亡率逐年增高，交感神经系统在其发展恶化过程中发挥重要的作用，以吉他西滨为基础的全身化疗是其主要临床治疗方案，但由于耐药的原因其疗效较差，如何提高吉他西滨的疗效是目前亟待解决的问题，在肝内胆管癌中交感神经系统与吉他西滨耐药是否相关也尚不明确。我课题组前期研究表明表明逍遥散能够通过影响神经元细胞而逆转微环境中癌细胞的增殖与侵袭，吉他西滨的耐药主要与具有外排作用的膜蛋白AGCB2和MRP1有关，且逍遥散的主要成分柴胡皂苷 D (SSD)能够通过调节多种 ABC 转运蛋白的活性来逆转化学耐药性；故本研究拟对肝内胆管癌中交感神经系统与吉他西滨耐药的关系以及SSD能否协同吉西他滨治疗肝内胆管癌及其分子机制进行研究。.（2）主要研究内容：网络药理学研究找到逍遥散抗焦虑的核心化合物及核心靶点，随后用分子对接及体内动物模型进行验证。通过体外细胞实验证明交感神经系统通过激活ADRB2受体促进iCCA细胞增殖并对吉他西滨耐药，且ADRB2可促进iCCA细胞的糖酵解及膜蛋白AGCB2和MRP1的表达。SSD可抑制ADRB2与吉他西滨协同治疗肝内胆管癌。机制方面旨在验证ADRB2对吉他西滨产生耐药的分子机制以及SSD逆转吉他西滨耐药的分子基础。.（3）重要结果：ADRB2/糖酵解信号通路可以在慢性应激（用 E 和 NE 刺激）下的 iCCA 细胞系中诱导吉西他滨耐药性。SSD能够抑制ADRB2的表达进而抑制iCCA细胞的糖酵解，糖酵解被抑制产生ATP和乳酸减少，进而降低ABCG2和MRP1的表达，从而使得吉他西滨进入癌细胞的含量增加，促进其发挥抑癌作用。.（4）关键数据：本研究证实了ADRB2/糖酵解信号通路可以在慢性应激（用 E 和 NE 刺激）下的 iCCA 细胞系中诱导吉西他滨耐药性。 SSD可通过抑制ADRB2的表达显著逆转这种治疗耐药性，从而协同吉他西滨治疗肝内胆管癌。.（5）科学意义:本研究证实了ADRB2可诱导吉西他滨耐药，SSD通过抑制ADRB2与吉他西滨协同治疗肝内胆管癌，初步探讨了ADRB2/糖酵解信号通路，为肝内胆管癌治疗的化学耐药问题提供了全新的治疗方法，有一定的临床价值。