逍遥散抗慢性应激损伤表观遗传学机制探讨

Significant anti-stress effects of Xiao Yao San has shown in numerous study results, but the exact mechanism has not yet been found. Reaserch in this aera in the past has been often started from the nerve-endocrine-immune point of view, and genetic studies of susseptbility to chronic stress has been reported also, thouth there is no sufficient evidence confirms that the direct correspondence exists between chronic stress susceptibility with DNA sequence. Research in the field of epigenetics provides a guideline for us to explore the mechanism of chronic stress further: susceptibility of a patient to chronic stress may be influenced not only by genetics (ie:changes in DNA sequence), but also by epigenetics that includes DNA methylation, histone medification and micro RNA-mediated gene regulation,which could help us to study the mechanism of chronic stress. In this study, based on the earlier research , the DNA methylation profile of chronic stress rats would be investigated, to explore the possible epigenetic anti-chronic stress mechanisms of Xiaoyaosan, and our research could provide new ideas for the study of anti-stress mechanism of traditional Chinese medicine,and provide basis for further study on the epigenetic mechanism of all kinds of psychological default caused by chronic stress.

大量研究结果证实逍遥散具有明确的抗应激损伤作用，但其作用机制目前尚未明晰。目前为止，慢性应激相关疾病的易感性遗传学研究没有充分证据证明其与DNA序列具有直接对应关系。表观遗传学领域的研究为我们进一步探寻慢性应激损伤机制提供了思路：慢性应激损伤易感性可能不仅涉及DNA序列的改变，还与后天环境因素作用下DNA发生可逆性突变有关，即各种环境因素通过影响DNA甲基化状态、组蛋白修饰及非编码RNA的作用实现调控基因的目的。本研究拟在前期研究的基础上，从探索慢性应激相关基因甲基化修饰层面入手，研究逍遥散抗慢性应激损伤可能存在的表观遗传学机制，为逍遥散抗应激损伤作用机制研究提供新的研究思路，同时也为探索慢性应激导致各种精神、神经功能障碍可能存在的表观遗传学机制提供实验依据。

本研究基于全基因组表达谱芯片及全基因组甲基化测序联合分析筛选慢性应激损伤引起甲基化修饰改变的基因，同时观察逍遥散对筛选基因相应位点甲基化变化的影响，探讨慢性应激损伤及逍遥散抗慢性应激损伤可能存在的表观遗传学机制。.研究在全基因组表达谱芯片及全基因组甲基化测序基础上通过多层次分析，筛选出11个基因，其基因表达变化可能与慢性应激导致基因甲基化修饰改变有关、逍遥散干预有效且功能具有代表性。对这11个基因进行表达验证，结果显示：慢性应激能够显著影响Atxn1、Gabra4、Npas2、Stk32c、Cacnb4、Sgk1、Kcnh5、Gpat2、Gabrd、Camk4、Myoz2这11个基因在转录水平和翻译水平的表达变化，其中Atxn1、Stk32c、Kcnh5、Gpat2、Gabrd、Camk4的表达趋势与表达谱芯片结果一致，Gabra4、Npas2、Myoz2、Sgk1、Cacnb4的表达趋势与表达谱芯片结果不一致。逍遥散干预能够明显回调Gabra4、Npas2、Stk32c、Cacnb4、Myoz2的表达，而对Atxn1、Sgk1、Gpat2、Gabrd基因仅在翻译（蛋白）水平显示出逆转表达作用，在转录（mRNA）水平未显示回调作用，对Kcnh5和Camk4基因，逍遥散没有逆转慢性应激对其造成的表达改变。与表达谱芯片结果完全一致（包括转录水平、翻译水平表达改变趋势）的基因只有Stk32c。.基于以上结果再次筛选出Atxn1、Gabra4、Npas2、Stk32c、Myoz2基因进行质谱甲基化检测。经质谱甲基化检测验证，最终有Gabra4、Npas2、Stk32c 3个基因的表达变化与慢性应激引起其特定区段的甲基化修饰有关，而逍遥散能够通过改变相应区段的甲基化水平逆转其表达变化，从而发挥抗慢性应激损伤作用。.Gabra4编码γ-氨基丁酸受体α4亚基，是重要的抑制性神经调节系统成员之一，与孤独症的易感性、疼痛应答、抑郁症及双相障碍等病理生理过程相关。Npas2是神经元PAS域蛋白2的编码基因，是控制生物钟节律的核心基因之一，通过调控24小时昼夜节律影响多个生物学过程。其特定位点的多态性改变对睡眠行为、昼夜行为偏好（早晨或夜晚倾向）以及冬季抑郁症，季节性情绪紊乱和自闭症均有影响。外周组织Npas2表达改变可能参与肿瘤发生发展的病理机制。Stk32c编码丝氨酸/苏氨酸激酶，功